Este protocolo permite la identificación y aislamiento de células madre cancerosas de una manera robusta utilizando ensayos funcionales y caracterización fenotípica. El aislamiento de células madre cancerosas de una muestra tumoral podría ser una plataforma para guiar la aplicación clínica de terapias específicas a tumores individuales, prediciendo resistencia y consecuente reocurrencia. Para preparar cultivos de suspensión no adherentes, cubra primero los recipientes de cultivo celular con 50 microlitros por centímetros cuadrados de 15 miligramos por mililitro de poliHEMA, y coloque los recipientes en un horno de secado de 37 grados Centígrados durante al menos dos días.
Cuando los recipientes estén completamente secos, lave en 80 a 90 por ciento el cultivo de la línea celular del cáncer confluente con PBS, y separe las células con uno a dos mililitros de trippsina EDTA. Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, detenga la reacción con dos o cuatro mililitros de medio de cultivo celular fresco y lave las células disociadas por centrifugación. Re-suspender el pellet en medio de cultivo fresco para el recuento, y diluir las células en el medio de cultivo de esfera fresca que contiene dos por ciento de celulosa de metilo a una concentración de 500 a 2000 células por centímetro cuadrado por mezcla de plato de cultivo.
Para garantizar la monoconalidad de la esfera, sembra cada línea celular a baja densidad en un entorno libre de anclaje. Luego sembrar las células en las placas recubiertas de poliHEMA para una incubación de cinco días a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono, añadiendo diez nanogramos por mililitro de factor de crecimiento epidérmico y diez nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básicos al medio de cultivo celular cada dos días. De tres a doce días después del enchapado, las colonias celulares tridimensionales en forma de bola deben observarse mediante microscopía de luz.
Para obtener poblaciones adherentes derivadas, transfiera las esferas a un nuevo plato de cultivo bajo las condiciones de cultivo apropiadas para la línea celular de cáncer original. Después de uno o dos días de cultivo, se debe observar una monocapa celular creciendo alrededor de las esferas adherentes con una morfología similar a la de la línea de origen celular. Para determinar la capacidad de formación de esferas de la línea de interés de las células cancerosas, después de completar el protocolo de formación de esferas, recoger las esferas por centrifugación.
Resuspender suavemente el pellet de la esfera en medio fresco, y utilizar un hemociclometro para contar el número de esferas con un diámetro superior a 40 micrómetros. A continuación, calcule la relación porcentual de la esfera obtenida frente al número de celdas inicialmente chapadas. Para determinar la capacidad de auto-renovación de la línea celular de interés, recoger las esferas por centrifugación y resuspender suavemente el pellet de la esfera en tripina EDTA para una incubación de cinco minutos a 37 grados celsius.
Al final de la incubación, añadir enzima y medio de activación al tubo, y pipetear la solución para obtener una suspensión de una sola célula. Usando un hemociclomekil y el método de exclusión azul trypan, cuente las células viables en la suspensión y placa las células en placas recubiertas de polyHEMA para un ensayo de formación de esferas como se acaba de demostrar. Después de ocho días, utilice un hemocicómetro para contar el número de esferas con un diámetro de más de 40 micrómetros, y calcule la proporción porcentual de esferas obtenidas frente al número de celdas inicialmente chapadas.
Para evaluar el área ocupada por las esferas, coloque el plato de cultivo en el escenario de un microscopio invertido equipado con un módulo de adquisición de imágenes y seleccione un aumento de 100X a 400X. Obtenga imágenes de al menos diez campos aleatorios por condición y utilice un programa de software de análisis de imágenes adecuado para dibujar regiones de interés alrededor de las esferas. A continuación, mida el área de cada región de interés en píxeles y calcule el área de proyección de la esfera como el área media de los píxeles medidos.
La caracterización funcional de la capacidad de formación de esferas, la auto-renovación y el área de proyección de las células madre cancerosas permite una comparación de su linaje distante y tejido de origen. El protocolo de formación de esferas permite obtener colonias esféricas en suspensión a partir de varias líneas celulares de cáncer de mama y endometrio o después de una digestión enzimática suave de tejidos de muestras de tumores humanos. Tanto las esferas endometrial como la de cáncer de mama dan lugar a una monocapa celular con morfologías similares a su línea de origen celular de uno a dos días después del enchapado.
En estos experimentos representativos, las células MCF-7 del cáncer de mama positivo del receptor hormonal demostraron una mayor capacidad de formación de esferas, capacidad de auto-renovación y área de proyección que las células de cáncer de mama HCC1806 triple negativas. Además del enriquecimiento de células madre cancerosas a través del protocolo de formación de esferas, recomendamos una evaluación adicional de su tallo utilizando métodos complementarios como la citometría de flujo. En este análisis representativo de esferas obtenidas a partir de líneas celulares endometriales, se identificaron cuatro poblaciones de células que expresaban marcadores de células madre cancerosas en cada línea celular por citometría de flujo.
La evaluación de las esferas tumorales por otras técnicas de biología molecular puede ser confirmatoria de la plastividad, y la plasticidad de las células madre cancerosas y facilitó el desarrollo de terapias dirigidas. El análisis de manchas occidentales después de la recolección suave de la esfera también reveló un fenotipo de células madre cancerosas para las esferas generadas in vitro. Este protocolo de aislamiento contribuye a nuestra comprensión de la importancia de las células madre cancerosas, lo que se traduce clínicamente en la comprensión de las recaídas, metástasis y resistencia al tratamiento.
