Этот протокол позволяет идентифицировать и изоляцию раковых стволовых клеток надежным образом, используя функциональные анализы и фенотипические характеристики. Изоляция стволовых клеток рака от образца опухоли может быть платформой для руководства клинического применения конкретных методов лечения отдельных опухолей, прогнозирования резистентности и последующего повторения. Для подготовки культур подвески, не придерживающихся, сначала покрыть контейнеры клеточной культуры с 50 микролитров на сантиметры в квадрате 15 миллиграммов на миллилитр полиХЕМА, и поместить контейнеры в 37 градусов по Цельсию сушки печи, по крайней мере два дня.
Когда контейнеры полностью высохнут, мыть в 80 до 90 процентов стечения культуры линии раковых клеток с PBS, и отделить клетки с одним-двумя миллилитров трипсина EDTA. Через пять минут при 37 градусах по Цельсию, остановить реакцию с двух до четырех миллилитров свежей среды культуры клеток, и мыть диссоциированных клеток центрифугации. Повторно приостановить гранулы в свежей среде культуры для подсчета, и разбавить клетки в свежей среде культивирования сферы, содержащей два процента метил-целлюлозы на 500 до 2000 клеток в сантиметре на концентрацию блюда культуры.
Для обеспечения монокональности сферы, семенной каждой линии клеток при низкой плотности в среде, свободной от якорной стоянки. Затем посеять клетки на полиХЕМА покрытием пластин в течение пяти дней инкубации при 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа, добавив десять нанограмм на миллилитр эпидермального фактора роста и десять нанограмм на миллилитр основных фибробластов фактор роста в клеточной культуре среды каждые два дня. Через три-двенадцать дней после покрытия трехмерные колонии клеток в форме шара должны наблюдаться с помощью световой микроскопии.
Для получения производных популяций адептов, перенесите сферы в новое культурное блюдо в соответствующих культурных условиях для первоначальной линии раковых клеток. После одного-двух дней культуры, монослой клетки следует наблюдать растет вокруг адепта сферы с морфологией похож на клеточной линии происхождения. Для определения сферообразующей способности линии раковых клеток, интересной, после завершения сферообразующего протокола, собирайте сферы путем центрифугации.
Аккуратно повторно посовечите гранулы сферы в свежей среде и используйте гемоцитометр для подсчета количества сфер диаметром более 40 микрометров. Затем вычислите процентное соотношение полученной сферы по сравнению с числом клеток, первоначально поцаавных. Чтобы определить способность к самообувеплению клеточной линии интереса, соберите сферы путем центрифугации и аккуратно повторно посовела гранулы сферы в трипсине EDTA в течение пяти минут инкубации при 37 градусах цельсия.
В конце инкубации добавьте фермент и средства активации в трубку, а также пипетку раствор для получения одноклеточной подвески. Используя гемоцитометр и метод trypan синего исключения, подсчитайте жизнеспособные клетки в подвеске и пластины клеток в полиХЕМА покрытием пластин для сферообразующего анализа, как только что продемонстрировано. Через восемь дней используйте гемоцитометр для подсчета количества сфер диаметром более 40 микрометров и расчета процентного соотношения полученных сфер по сравнению с количеством изначально потроханых клеток.
Для оценки площади, занимаемой сферами, поместите блюдо культуры на сцену перевернутого микроскопа, оснащенного модулем получения изображений, и выберите увеличение от 100X до 400X. Получить изображения по крайней мере десять случайных полей в состоянии, и использовать соответствующую программу анализа изображений, чтобы привлечь регионов, представляющих интерес вокруг сфер. Затем измерьте область каждой области, представляющие интерес для пикселей, и вычислите область проекции сферы как среднее количество измеренных пикселей.
Функциональная характеристика сферообразующей способности, самооб обновления и проекционной области раковых стволовых клеток позволяет сравнить их далекую родословную и ткани происхождения. Протокол формирования сфер позволяет получать сферические колонии в суспензии из нескольких линий клеток рака эндометрия и молочной железы или после мягкого энзиматичного пищеварения тканей из образцов опухоли человека. Оба эндометрия и рака молочной железы сферы привести к монослой клетки с аналогичными морфологии их клеточной линии происхождения один-два дня после покрытия.
В этих репрезентативных экспериментах, гормональный рецептор положительный рак молочной железы MCF-7 клетки продемонстрировали более высокую способность к образованию сферы, способность к самообнаветию, и проекционные области, чем тройной отрицательный HCC1806 раковых клеток молочной железы. Помимо обогащения раковых стволовых клеток с помощью протокола формирования сферы, мы рекомендуем дальнейшую оценку их стволовости с использованием дополнительных методов, таких как цитометрия потока. В этом репрезентативном анализе сфер, полученных из линий клеток эндометрия, четыре популяции клеток, выражают маркеры раковых стволовых клеток, были выявлены в каждой клеточной линии по цитометрии потока.
Оценка опухолевых сфер другими методами молекулярной биологии может быть подтверждением стволовости, пластичности раковых стволовых клеток и способствовать разработке целевых методов лечения. Западный анализ помарки после нежной сферы уборки также показал фенотип стволовых клеток рака для in vitro генерируемых сфер. Этот протокол изоляции способствует нашему пониманию значения стволовых клеток рака, что клинически приводит к пониманию рецидива, метастазов и устойчивости к лечению.
