Este protocolo permite a identificação e isolamento de células-tronco cancerígenas de forma robusta usando ensaios funcionais e caracterização fenotípica. O isolamento de células-tronco cancerígenas de uma amostra de tumor pode ser uma plataforma para orientar a aplicação clínica de terapias específicas a tumores individuais, prevendo resistência e consequente recorrência. Para preparar culturas de suspensão não aderentes, primeiro cubra os recipientes de cultura celular com 50 microliters por centímetros quadrados de 15 miligramas por mililitro de poliHEMA, e coloque os recipientes em um forno de secagem Celsius de 37 graus por pelo menos dois dias.
Quando os recipientes estiverem totalmente secos, lave em 80 a 90% a cultura de linha de células cancerígenas confluentes com PBS, e desprende as células com um a dois mililitros de trippsina EDTA. Depois de cinco minutos a 37 graus Celsius, prenda a reação com dois a quatro mililitros de cultura celular fresca, e lave as células dissociadas por centrifugação. Suspenda a pelota em meio de cultura fresca para contar, e dilua as células em meio de cultivo de esferas frescas contendo 2% de celulose de metila a uma concentração de 500 a 2000 células por centímetro por centímetro por cultura.
Para garantir a monoconalidade da esfera, semente cada linha celular em baixa densidade em um ambiente livre de ancoragem. Em seguida, semeou as células nas placas revestidas de poliHEMA para uma incubação de cinco dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, adicionando dez nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico e dez nanogramas por mililitro de fator básico de crescimento do fibroblasto para o meio da cultura celular a cada dois dias. Três a doze dias após o revestimento, colônias tridimensionais de células em forma de esfera devem ser observadas por microscopia leve.
Para obter populações derivadas, transfira as esferas para um novo prato de cultura sob as condições culturais adequadas para a linha celular original do câncer. Após um a dois dias de cultura, uma monocamada celular deve ser observada crescendo ao redor das esferas aderentes com uma morfologia semelhante à da linha celular de origem. Para determinar a capacidade de formação da esfera da linha de interesse celular canceroso, após a conclusão do protocolo de formação de esferas, colete as esferas por centrifugação.
Resuspenque suavemente a pelota da esfera em meio fresco e use um hemócito para contar o número de esferas com diâmetro superior a 40 micrômetros. Em seguida, calcule a razão percentual da esfera obtida versus o número de células inicialmente emplacados. Para determinar a capacidade de auto-renovação da linha de interesse celular, colete as esferas por centrifugação e resuspenque suavemente a pelota da esfera na EDTA de trippsina para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação, adicione enzima e meio de ativação ao tubo, e pipete a solução para obter uma suspensão unicelular. Usando um hemótmetro e o método de exclusão azul trypan, conte as células viáveis na suspensão e plaque as células em placas revestidas de poliHEMA para um ensaio de formação de esferas como apenas demonstrado. Após oito dias, use um hemócito para contar o número de esferas com mais de 40 micrômetros de diâmetro, e calcular a razão percentual das esferas obtidas versus o número de células inicialmente emplacados.
Para avaliar a área ocupada pelas esferas, coloque o prato de cultura no palco de um microscópio invertido equipado com um módulo de aquisição de imagem e selecione uma ampliação de 100X a 400X. Obtenha imagens de pelo menos dez campos aleatórios por condição e use um programa de software de análise de imagem apropriado para atrair regiões de interesse ao redor das esferas. Em seguida, meça a área de cada região de interesse em pixels e calcule a área de projeção da esfera como a área média dos pixels medidos.
A caracterização funcional da capacidade de formação da esfera, a auto-renovação e a área de projeção das células-tronco cancerígenas permite uma comparação de sua linhagem distante e tecido de origem. O protocolo de formação de esferas permite que colônias esféricas sejam obtidas em suspensão de várias linhas celulares endometrial e câncer de mama ou após a suave digestão enzimática de tecidos de amostras de tumores humanos. Tanto as esferas endometrial quanto o câncer de mama dão origem a uma monocamada celular com morfologias semelhantes à sua linha celular de origem de um a dois dias após o revestimento.
Nestes experimentos representativos, as células de câncer de mama positivo do receptor hormonal MCF-7 demonstraram maior capacidade de formação de esferas, capacidade de auto-renovação e área de projeção do que as células cancerígenas de mama HCC1806 três meses negativos. Além do enriquecimento de células-tronco cancerígenas através do protocolo de formação de esferas, recomendamos a avaliação posterior de sua haste usando métodos complementares, como a citometria de fluxo. Nesta análise representativa das esferas obtidas a partir de linhas celulares endometrial, foram identificadas quatro populações de células expressas marcadores de células-tronco cancerígenos em cada linha celular por citometria de fluxo.
A avaliação das esferas tumorais por outras técnicas de biologia molecular pode ser confirmatória da haste, plastificidade das células-tronco cancerígenas e facilitou o desenvolvimento de terapias-alvo. A análise da mancha ocidental após a colheita suave da esfera também revelou um fenótipo de células-tronco de câncer para as esferas geradas in vitro. Este protocolo de isolamento contribui para a nossa compreensão da significância das células-tronco do câncer que se traduz clinicamente na compreensão da recaída, das metástases e da resistência ao tratamento.
