定量的多重共免疫沈降(QMI)により、ユーザーは事前定義されたタンパク質相互作用ネットワーク内で数百のバイナリ相互作用を同時に測定できます。同じライセートで同時に複数のコIPを実行することにより、バイオインフォマティクス技術は、連会合のグループが協調的にどのように変化するかを調べることができます。アッセイは開発に時間がかかりますが、QMIパネルが手に入ると、比較的簡単に一晩のアッセイで信号伝達システムに関するネットワークスケールデータを収集できます。
QMIは、96のウェルプレートに異なるサンプルと試薬の正確なピペットを必要とします。エラーを防ぐために、各アッセイを設定して実行する際には注意深く注意してください。サンプル調製および免疫沈降のために、まず、サンプルをプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤で適切な洗剤で氷上で15分間インキュベーションすることから始めます。
インキュベーションの最後に、サンプルをスピンダウンして膜や破片を除去し、上澄み物にBCAアッセイを行い、標準的なプロトコルに従ってタンパク質濃度を決定します。タンパク質濃度を正常化した後、各クラスの約250個の磁気ビーズを含む磁気ビーズマスターミックスを井戸ごとに調製します。磁気分離を使用して、サンプル当たり20マイクロリットルのFly Pバッファーでビーズを再懸濁する前に、Fly Pバッファーで磁気ビーズミックスを2回洗浄します。
徹底的なピペッティングの後、サンプルごとに1つの氷冷微小遠心チューブに20マイクロリットルのビーズをアリコートし、免疫沈降のために各チューブに正規化されたタンパク質濃度のライセートの等量を追加します。次に、各ライセートサンプルを1つのチューブに分け、各プレートが実行され、一晩で光から保護された摂氏4度で回転器上のサンプルを免疫沈降させます。翌朝、磁気ビーズラックを使用して最初のチューブセットからライセートを取り除き、洗浄ごとに500マイクロリットルの氷冷フライPバッファーでビーズを2回洗浄します。
再懸濁液量を計算した後、氷冷フライPバッファーの計算された体積中の免疫沈降を再懸濁する。穏やかなピペットで磁気ビーズを徹底的に再中断し、氷の上の平底96ウェルプレート全体にウェルあたり25マイクロリットルのビーズを分配します。異なる96ウェルプレートにおいて、2倍の作動濃度に対するアチニレートプローブ抗体により希釈する。
マルチチャネルピペットを使用して、各プローブ抗体希釈液の25マイクロリットルをアッセイプレートを含む磁気ビーズの適切なウェルに分配し、水平プレートシェーカーで高速で振って磁気ビーズを混合して再中断します。混合後、光から保護された摂氏4度で1時間のインキュベーション速度を下げます。インキュベーションの終わりに、4°Cの磁気プレートワッシャーで洗浄ごとに新鮮なFly Pバッファーでプレートを3回洗います。
最後の洗浄後、ビードを50マイクロリットルのストレプトアビジンPEで再懸濁し、フライPバッファーで1~200に希釈します。ミックスを振り、光から保護された30分間摂氏4度でプレートをインキュベートする前に、ビーズを再中断します。インキュベーションの終わりに、4°Cの磁気プレートワッシャーのFly Pバッファでプレートを3回洗浄し、Fly Pバッファの125マイクロリットルでビーズを再中断します。
900回転でプレートを1分間振ってビーズを徹底的に再中断し、プレートを再冷蔵庫で再冷蔵庫されたフローサイトメーターにロードします。フローサイトメーターソフトウェアで、高 RP1 ターゲット設定、リージョンあたり 1,000 ビーズの停止条件、および 80 マイクロリットルのサンプル容量を選択します。途中で実行を一時停止し、沈降を防ぐためにビードを再中断します。
実行の最後に、データ ファイルを XML 形式でエクスポートします。ANC解析を実行するには、ANC入力ファイルに記入して実験計画の詳細を反映し、プログラムを実行します。ヒットで終わるファイル。
csvは、4つの実験反復のうち少なくとも3つのコントロールと実験条件の間で0.05の偽陽性レベルで有意に異なるタンパク質の共連を報告する。重み付け相関ネットワーク解析の場合は、Matlab で終わるデータファイルの列タイトルを mfi で貼り付けます。csv を新しいスプレッドシートの最初の列に追加し、実験番号の実験と実験処理の処理と分析するその他の変数の列を追加します。
このファイルをトレイトとして保存します。csv と R スタジオを開きます。作業ディレクトリを mfi を含むフォルダに設定します。
csvと特性。csv ファイル、コードのセクションを強調表示し、コマンド Enter を押して、コメントされたコマンド ファイルに示されている R コマンドを実行します。各実験特性と有意に相関する重み付け相関ネットワーク解析モジュールは、グラフィックファイルとして出力され、各モジュールとの各相互作用の相関はCSVファイルとして出力されます。
ANC 出力ファイル内の各相互作用について、その相互作用が CNA によっても重要であるかどうかを識別し、各 ANC ヒットが CNA ヒットでもあるかどうかを示す新しい列を作成します。値を 2 つの折り返し変更をログに変換し、すべての ANC 共用体 CNA ヒットの平均値を計算します。最後に、1つの列に免疫沈降目標によってリストされた各ANCユニオンCNAヒット、2番目の列のプローブターゲット、および3番目の列の折り畳み変化値を持つ新しいスプレッドシートを作成します。
このファイルを Cytoscape にネットワークとしてインポートして、ノード エッジ図を作成します。2つの独立した統計的アプローチによって同定された高信頼タンパク質相互作用は、オープンソースソフトウェアCytoscapeを使用してノードエッジ図として、または補足資料に含まれるRコードと分析指示を使用してヒートマップとして視覚化されます。プロトコル全体を通して、ユーザーは正確にピペットに注意を払い、細心の注意を払って記録を保持し、サンプルを常に冷たく保つ必要があります。
QMIを用いて、シグナル伝達経路が異なる入力タイプを区別し、複数の受容体からの情報を統合する方法を理解しました。
