Este protocolo nos permite monitorear la dinámica de interacción y la resolución de la unión de Holliday por flap endonuclese 1 a nivel de molécula única y otros sistemas enzimáticos. Bueno, algunos promediarán en toda la población molecular o asegurarán los pasos mecánicos individuales subyacentes y lo hay. Los métodos de molécula única proporcionan estos detalles mediante el monitoreo del comportamiento en tiempo real de las moléculas individuales.
Los métodos de molécula única pueden detectar eficientemente interacciones biomoleculares en el rango pico y nanomolar con alta especificidad. Lo cual es útil para muchas soluciones prácticas en diagnóstico, secuenciación del genoma y detección. Los métodos ópticos y forzados de medición de una sola molécula se aplican ampliamente en Física, Química y Biología y se ha demostrado que proporcionan observaciones nobles que son inaccesibles por otros métodos.
Mi consejo a los usuarios por primera vez es que sigan de cerca los pasos detallados establecidos en este protocolo. Las ilustraciones visuales del procedimiento práctico de este protocolo conducirán a una implementación exitosa de la técnica. Para preparar la celda de flujo de un solo canal, comience perforando dos agujeros de 1,22 milímetros de diámetro en la parte media de un portaobjetos de 50 por 20 milímetros con los centros de 37 milímetros de separación y 6,5 milímetros desde el borde de la diapositiva.
Utilice un cortador electrónico para cortar un canal de 41 por 2,25 milímetros en una pieza de 50 por 20 milímetros de una hoja adhesiva doble y despegar el lado plástico de la cubierta protectora. Alinee los bordes de la pieza con los bordes de la diapositiva de cuarzo y utilice un par de pinzas de politetrafluoroetileno para eliminar suavemente las burbujas de aire atrapadas. Retire el lado del papel de la pieza adhesiva y monte la pieza en la superficie funcionalizada de un resbalón de cubierta.
A continuación, corte una pieza de tubo de polietileno con un diámetro interno de 1,22 milímetros a una longitud de 11 centímetros para la entrada y una pieza de tubo a 25 centímetros para la salida. A continuación, inserte los tubos en los orificios previamente perforados como los tubos de entrada y salida de la celda de flujo. Y utilice pegamento epoxi de cinco minutos para sellar los bordes de la interfaz de deslizamiento de la cubierta de cuarzo en los tubos de entrada y salida.
Cuando la célula se haya secado, utilice una jeringa de 1 milímetro para vaciar 0,2 micrómetros filtrados 0,03 miligramos por mililitro de la concentración de avidina en PBS en la célula utilizando una segunda jeringa llena de tampón solo para lavar cualquier exceso de avidina al final de la profusión. Para realizar un experimento FRET de un solo color, primero aplique una gota de aceite de inmersión en un objetivo de fluorescencia de reflexión interna total 100 veces y establezca la multiplicación en chip de fotoelectrones en una ganancia adecuada para optimizar la señal en el fondo y evitar la saturación. Coloque cuidadosamente la celda de flujo en el portacuchillas y utilice el ajuste del curso para elevar gradualmente el objetivo hasta que el aceite toque el resbalón de la cubierta.
Encienda el láser de 532 nanómetros y cambie al modo de ajuste fino del objetivo. Dirija la emisión al puerto de la cámara para observar la imagen en el monitor y ajustar la altura del objetivo hasta que la superficie funcionalizada del resbalón de la cubierta se enfoque y se pueda observar en el monitor. Compruebe que el fondo de la superficie funcionalizada de los resbalones de la cubierta no exceda de pocos puntos antes de fluir en el HJ con la etiqueta fluorescente. Cuando el sistema esté listo a 0,2 a 0,5 microlitros del sustrato diluido de interés en 120 microlitros de tampón de imágenes con sistema de barrido de oxígeno en un tubo de 0,5 mililitros y conecte la salida de la célula lenta a una bomba de jeringa.
Inserte el tubo de entrada en el tubo de 1,5 mililitros e inicie la bomba de la jeringa a un microlitro de 30 a 50 microlitros por minuto para extraer la solución del tubo. Imagen frecuente de la superficie brevemente con el láser verde para confirmar una buena cobertura de la célula con 100 a 300 partículas de sustrato distribuido homogéneamente, bien espaciado. Si la superficie de la célula de flujo está adecuadamente cubierta, enjuague otros 120 microlitros de búfer de imágenes a 30 a 50 microlitros por minuto para lavar cualquier HJ no atlado y permita que la célula de flujo se siente durante 5 minutos para permitir que el sistema de esquivar oxígeno agote el oxígeno disuelto.
Establezca el tiempo de exposición en aproximadamente 60 milisegundos. El tiempo de ciclo será configurado automáticamente por el software en función de la velocidad de transferencia de datos. Especifique el número deseado de ciclos o fotogramas a aproximadamente 400.
La emisión de los fluoróforos del donante y del aceptador se divide en canales de color por un dispositivo divisor de imagen. Seleccione un área adecuada en la superficie, ajuste la altura del objetivo para enfocar la imagen y grabar y guarde la película en formato tiff de 16 bits. A continuación, muévase a un área nueva.
Enjuague la célula con 120 microlitros de tampón de imágenes complementados con las concentraciones indicadas de GEN1 a un caudal de 30 microlitros por minuto, una concentración a la vez. En la resolución del experimento de escote HJ, ajuste el caudal a 110 microlitros por minuto e inicie la grabación de 5 a 10 segundos antes de la entrada de la enzima en la célula de flujo. la imagen para comenzar de 5 a 10 segundos antes de la entrada de la enzima en la célula de flujo maximizará el número de eventos.
Una vez probadas todas las concentraciones, utilice una corredera de perlas fluorescentes fijas para asignar las partículas de donante y aceptador entre sí en el dispositivo de división de imágenes. Después de instalar el paquete de software adecuado para generar una matriz de transformación, abra la película de diapositivas de cuentas grabada y seleccione las posiciones de las perlas individuales en los canales de donante y aceptador. Cuando la matriz se haya generado a partir de la diapositiva de cordón fijo, haga clic en Cargar TFORM y seleccione el archivo de matriz de transformación.
En el menú desplegable del filtro de canal, haga clic en la opción D&A para seleccionar las partículas etiquetadas tanto con el donante como con el aceptador. A continuación, introduzca plotTimetraceCW como se indica en el manual para generar las trazas de tiempo para cada molécula. Para realizar un experimento ALEX FRET, grabe una película compuesta por fotogramas consecutivos de emisiones de donantes y aceptadores mediante excitaciones directas con los láseres verdes y rojos.
Abra las películas ALEX adquiridas y establezca el umbral de detección adecuado en aproximadamente 300 para cada una de las emisiones del donante debido a la excitación del donante, la emisión del aceptador debido a la excitación del donante y la emisión del aceptador debido a los canales de excitación directa. Aplique los filtros de canal adecuados para seleccionar las partículas que han sido tanto donantes como receptores y vinculen de 200 a 300 partículas en cada uno de los tres canales. Utilice el código plotHistALEX MATLAB para generar histogramas ALEX que se ajusten a diferentes picos en las funciones del histograma y utilice un programa de gráficos y análisis adecuado para determinar el porcentaje del área debajo de la curva para cada población.
A continuación, utilice el código plotTimetraceALEX MATLAB para generar un seguimiento de tiempo para cada molécula que muestre la emisión del donante por la excitación directa en las emisiones del aceptador debido al FRET y la excitación directa. Este histograma FRET de excitación alterna representativa de la etiqueta adyacente X-0 muestra dos picos que corresponden al intercambio de los isómeros más abundantes y menos abundantes. Las tasas de isomerización obtenidas de los histogramas de tiempo de morada de los isómeros son consistentes con las notificadas anteriormente.
Los histogramas FRET de molécula única de la etiqueta adyacente X-0 se unen a diferentes concentraciones GEN1 adquiridas por ALEX, revelan un pico correspondiente al isómero FRET alto libre y un pico correspondiente a la población de HJ ligada después de restar la contribución del isómero menos abundante del pico FRET bajo. En una concentración GEN1 saturante, el histograma FRET de X-0 tiene sólo un pico FRET bajo correspondiente a GEN1 enlazado a cualquiera de los isómeros del HJ según lo previsto por el modelo. La unión del monómero GEN1 al HJ seguido de la formación de dimer es una característica única del eucariota HJ resolvase GEN1 en comparación con las resoluciones procariotas que existen en forma dimerica en solución.
La evidencia adicional de que el monómero GEN1 une y distorsiona el HJ es la observación de un número significativo de trazas de partículas apeadas con un estado FRET bajo estable en presencia de magnesio a bajas concentraciones de GEN1. La salida simultánea del donante y del receptor después de un estado FRET bajo estable en trazas de X-0 resueltos que se produce sin la aparición de un intermedio indica que se produce una resolución completa dentro de la vida útil del complejo GEN1 HJ. Tenga en cuenta que el fondo de la superficie de vidrio funcionalizada no debe exceder unos pocos puntos y que las partículas distribuidas uniformemente son esenciales para obtener buenos resultados.
Utilice siempre equipo de protección personal y una campana de humo mientras prepara la imagen de serialización. Asegúrese de usar gafas protectoras específicas para las longitudes de onda cuando trabaje con láseres. Otros métodos como el crio ap, la resonancia magnética nuclear, pueden proporcionar detalles estructurales a nivel atómico.
Esta información es integral para el diseño e interpretación de los experimentos FRET de molécula única. Fret de molécula única abre nuevas opiniones en el campo de la replicación del ADN, lo que resulta en una comprensión más profunda de los mecanismos de las acciones heliceses y nucleas.
