Así que nuestro modelo permite el estudio de la modulación post-transcripción de una transcripción específica en células epiteliales alveolares en el cultivo primario y sus condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Por lo tanto, la transfección transitoria de las células epiteliales alveolares primarias tiene un efecto mínimo en la fisiología celular y los metabolismos, lo que supone una clara ventaja sobre los protocolos clásicos que utilizan inhibidores de la transcripción. Para la generación de un plásmido de respuesta que exprese un gen de interés, la secuencia del gen y los múltiples sitios de clonación del vector inducible deben ser analizados para identificar las secuencias de reconocimiento en los múltiples sitios de clonación que no están presentes internamente en el gen.
Utilizando técnicas de alta fidelidad de taq polimerasa y PCR de superposición estándar, flanquee el gen de interés con dos sitios seleccionados de reconocimiento de enzimas de restricción utilizando imprimaciones de diseño. Debe incluirse una secuencia en la codificación del epítopo V5 aguas arriba del gen de interés para distinguir la expresión del gen trans infectado de la expresión endógena. Los mutantes se pueden generar mediante la eliminación secuencial para estudiar los efectos de diferentes regiones no traducidas en la estabilidad del ARNm del gen utilizando imprimaciones inversas que codifican un sitio de poliadenilación que elimina gradualmente los tres extremos principales de la región no traducida.
En última instancia, la inserción del gen de interés puede confirmarse mediante un análisis de restricciones. La orientación del gen y la ausencia de mutaciones potencialmente introducidas durante la rtPCR pueden confirmarse mediante secuenciación. Para la transfección de pulmón de rata primaria tipo dos células epiteliales alveolares, sembrar las células en un uno por 10 a las sextas células por centímetro cuadrado en platos Petri de 100 milímetros en presencia de medio esencial mínimo completo.
Cultivo durante 24 horas a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono con humedad. Al día siguiente, añadir 500 microlitros de medio completo sin antibióticos a cada pozo de una nueva placa de 12 pozos y precaliente la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Durante esta incubación, añadir un microgramo del plásmido de respuesta y un microgramo de vector regulador a un tubo de 1,5 mililitros por pozo.
Lavar las células epiteliales alveolares con 10 mililitros por pozo de 37 grados Celsius PBS sin calcio o magnesio y tratar las células con cinco mililitros por pozo de 37 grados Celsius 0.05%trypsin durante dos a cuatro minutos en la incubadora de cultivo celular. Cuando las células se hayan desprendido, neutralice la trippsina con 10 mililitros por pozo de medio completo sin antibióticos y recoja las células en un nuevo tubo de 50 mililitros. Lavar el plato con cuatro mililitros de medio fresco para recoger las células restantes y sedimentar las células por centrifugación.
Resuspender el pellet en un mililitro de PBS para contar y centrifugar las células de nuevo. Resuspender el pellet a una densidad de cuatro veces 10 a las séptimas células por mililitro de tampón de resuspensión y añadir cuatro veces 10 a las quintas células a cada tubo de plásmido y vector con mezcla suave. Coloque un tubo en el dispositivo de electroporación y llene el tubo con 3,5 mililitros de tampón electrolítico.
Presione completamente el pistón para insertar una punta de electrodo chapado en oro en una pipeta y mezcle suavemente el contenido del tubo. Aspire cuidadosamente las células con una pipeta e inserte la pipeta en la estación de electroporación hasta que se oirí un sonido de clic. Seleccione el protocolo de electroporación adecuado para las células epiteliales alveolares y pulse Iniciar en la pantalla táctil.
Inmediatamente después de la transfección, retire la pipeta y transfiera las células a un pocero de la placa de 12 pozos precale calentada. Cuando todas las células hayan sido electroporated y plateadas, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular, reemplazando el sobrenadante en cada pozo con un medio completo con antibióticos después de dos días. El éxito de la transfección puede ser confirmado por la expresión de EGFP como se observa mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo utilizando un vector de control.
Para inhibir la transcripción del gen de interés, 72 horas después de la transfección reemplazar el sobrenadante con un mililitro por pozo de medio completo complementado con un microgramo por mililitro de adoxiclina recién preparada. Para evaluar la vida media del GEN de ARNm, devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular de 15 minutos a seis horas. Lavar un pozo con un mililitro de PBS helado antes de la lesión de las células con 500 microlitros de tampón de lelisis de un kit de extracción de ARN de cloroformo fenol disponible comercialmente y un suave temblor en cada punto de tiempo experimental.
A continuación, aísle el ARN de acuerdo con las instrucciones del kit y determine el rendimiento y la pureza del ARN por espectrofotometría a 230, 260 y 280 nanómetros. Para determinar la estabilidad del ARN aislado, primero tratar un microgramo del ARN total de cada muestra con RNase libre de ADN para eliminar cualquier rastro de ADN plásmido. Utilice un kit de síntesis de ADNc disponible comercialmente con una mezcla de oligo dT y imprimaciones de hexómero aleatorio para mejorar la eficiencia de transcripción inversa para revertir la transcripción del ARN total agotado del ADN en el ADNnr de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Añadir 180 microlitros de agua de grado de biología molecular a los 20 microlitros de la mezcla de reacción para diluir la reacción de ADNc a una concentración de cinco nanogratros por microlitro y diluir inmediatamente la mezcla de ADNc con agua de grado de biología molecular fresca para alcanzar una concentración de 1,25 nanogramos por microlitro. Combine cinco microlitros de la mezcla maestra de colorante verde cibernético con 0,1 microlitros de agua de grado de biología molecular, 0,45 microlitros de imprimación delantera de 7,5 micromolares, 0,45 microlitros de imprimación inversa de 7,5 micromolares y cuatro microlitros de 1,25 microgramos por microlitro de cDNA para obtener un volumen de reacción total de 10 microlitros. Coloque las muestras en un termociclador qPCR y amplifique el gen de la etiqueta V5 de interés y los amplicons de avance del transactivador de tetrociclina utilizando las condiciones qPCR indicadas y genere una curva de fusión de alta resolución para evaluar las temperaturas de fusión específicas de los amplicons deseados y para garantizar la ausencia de picos de amplicon de ruido.
Esta técnica de electroporación de pipeta facilita una tasa de eficiencia de transfección de 25 a 30% observada por las proporciones de células EGFP detectadas por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. El tratamiento de las células epiteliales alveolares con un microgramo por mililitro de doxiciclina no tiene un impacto significativo en la expresión de ARNm alfa endógeno ENaC en cualquier momento durante el período de tratamiento. Utilizando un sistema de expresión de plásmido controlado transcripcional como se ha demostrado, la señal ENaC alfa V5 podría normalizarse de acuerdo con la señal avanzada del transactivador de tetraciclina para determinar la eficiencia de la transfección utilizando el método de ciclo de cuantificación de doble delta.
La vida media del ARNm alfa ENaC es hasta siete veces más corta en presencia del sistema de tetraciclina fuera que en presencia de actinomicina D, lo que confirma que la actinomicina D conduce a una estabilización de ARNm alfa ENaC artefacto. Además, el tratamiento alfa con factor de ciclohexamida y necrosis tumoral disminuyó significativamente la estabilidad de la transcripción, mientras que los lipopolisacáridos no. Se pueden inducir cambios significativos en la modulación de la estabilidad del ARNm alfa ENaC V5 dependiendo de las regiones eliminadas e incluidas de las tres regiones principales no traducidas.
Además, la expresión excesiva de proteínas específicas de unión al ARN disminuye la estabilidad del ARNm 5-alfa ENaC en comparación con la transfección con un pcDNA vacío de tres plásmidos. Esta herramienta será útil para consultar nuevos conocimientos sobre la regulación post-transcripción de genes clave implicados en la función del epitelio alveolar y sus condiciones fisiológicas o patológicas.
