Parasponia es un árbol tropical de la familia Cannabis que es capaz de establecer una simbiosis fijadora de nitrógeno con rizobio. Los estudios comparativos entre Parasponia y las legumbres podrían proporcionar información sobre las redes genéticas básicas subyacentes a la simbiosis del rizobio. Con este protocolo, parasponia andersonii líneas mutantes transgénicas estables se pueden generar en un período de dos a tres meses.
Estas líneas se pueden propagar eficientemente a través de la propagación in vitro. Este protocolo proporciona una plataforma experimental para estudiar la simbiosis rizobiana, así como otros aspectos de la biología de este árbol tropical. Las habilidades básicas en el cultivo de tejidos y la clonación molecular son suficientes para implementar este protocolo.
Esto permite a cualquier laboratorio adaptar Parasponia como modelo de investigación. Demostrando el procedimiento serán los estudiantes de doctorado Titis Wardhani y Yuda Roswanjaya junto con Marijke Hartog, un técnico en nuestro laboratorio. Para cultivar árboles de Parasponia andersonii, comience germinando las semillas.
Retire las semillas de las bayas de Parasponia frotando contra el interior de un tamiz de té o aplastándolas en un pedazo de papel tisú. Desinfecte las semillas con 4%hipoclorito durante 15 a 20 minutos, y luego lave las semillas seis veces con agua esterilizada. Transfiera las semillas a tubos estériles de PCR de 200 microlitros y llene los tubos con agua esterilizada para sumergir las semillas.
Incubar los tubos durante 10 días en un termociclo, según las instrucciones del manuscrito. Después de la incubación de 10 días, transfiera las semillas a placas SH-0 y ciérrelas con dos capas de lámina de sellado elástica para evitar el secado. Incubar a 28 grados centígrados con un ciclo de 16 horas al día, ocho horas de noche durante tres a cuatro semanas.
Una vez que las plántulas desarrollen su primer conjunto de hojas verdaderas, transcúyenlas a macetas llenas de tierra de maceta comercial, y cúbralas con una taza de plástico translúcido para evitar la desicación. Coloque las ollas en una sala de clima de humedad relativa de 28 grados, 85% o invernadero bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche. Después de una semana, retire la taza de plástico.
Regar regularmente las macetas, y complementar con fertilizante para sostener el crecimiento del árbol. Prepárese para la transformación cosechando ramas jóvenes de cinco a ocho centímetros de los árboles cultivados en invernadero, asegurándose de utilizar sólo ramas sanas y no infectadas. Cortar las hojas, dejando un centímetro cuadrado de tejido de la hoja al final de cada pecíolo.
Desinfectar el tejido durante 15 minutos con 2%hipoclorito que contiene unas gotas de polisorbato 20, y luego enjuagar ocho veces con agua autoclave. Re-suspende las células de Agrobacterium en 25 mililitros de media de infiltración a una densidad óptica de unos cinco. Corte el tallo y el tejido pecíolo en trozos de un centímetro dentro de la suspensión celular.
Retire los tejidos de las hojas e incubar las piezas del tallo y el pecíolo en la suspensión celular durante 10 a 30 minutos. Seque las piezas de los tejidos en un pedazo estéril de papel de filtro y colóquelos en un medio de enraizamiento preparado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Incubar las placas en la oscuridad a 21 grados centígrados durante dos días.
Después de los dos días, inspeccione las placas en busca de contaminación por hongos o bacterias y deseche las placas contaminadas. Transfiera las piezas de tejido a 10 mililitros de medio SH-10 preparados según las instrucciones del manuscrito. Deje el tejido en el medio durante al menos 10 minutos y agite suavemente cada dos o tres minutos para lavarlo.
Preparar medio de enraizamiento con cefotaxime y kanamicina de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y verter las placas. Seque los tejidos en trozos estériles de papel de filtro y transfieralos a las placas. Incubar placas durante siete días a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche.
Revise las placas en busca de contaminación por hongos o bacterias cada dos días. Si se produce contaminación, transfiera las piezas de tejido no infectadas a un plato nuevo. Después de siete días, transfiera las piezas de tejido al medio de propagación preparado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito e incubar a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche.
Refresque las placas una vez a la semana hasta que se desarrollen brotes transgénicos, asegurándose de transferir únicamente las piezas de tejido no infectadas a placas nuevas. Una vez que los brotes transgénicos putativos miten al menos un centímetro de largo, corte los brotes y escúlelos de forma independiente en el medio de propagación con antibióticos. Para asegurarse de que los brotes representan transformadores independientes, tome un solo disparo de cada lado de un explant.
Propagar el tejido colocando alrededor de 10 brotes en una placa fresca de medio de propagación y cerrando la placa con dos capas de lámina de sellado elástica. Incubar las placas a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche, y repetir este paso cada cuatro semanas. Cuando los brotes alcancen un centímetro de longitud, córtalos en su base y colóquelos en el medio de enraizamiento.
Coloque los disparos en posición vertical insertando la punta basal del brote en el medio. Se pueden colocar alrededor de 10 tomas en una sola placa. Comience preparando el rizobio inóculo.
Inocular 10 mililitros de medio líquido YEM de una sola colonia de Mesorhizobium plurifarium BOR2, e incubar a 28 grados centígrados durante dos días. Utilice este cultivo para inocular un mayor volumen de medio YEM líquido. Una vez cultivado, centrifugar el cultivo bacteriano durante 10 minutos a 3.500 veces g para cosechar las células.
Vuelva a suspender el pellet bacteriano en un medio líquido EKM y determine la densidad óptica. Preparar tres litros de medio EKM, que es suficiente para unos 20 macetas, e inocular con la suspensión rizobiana. Mezclar el medio con 1,25 kilogramos de perlita, y añadir 210 gramos de esta mezcla a las ollas de polipropileno translúcido estéril.
Planta de una a tres plantaciones de Parasponia andersonii en cada maceta, y prepara varias macetas con plantlets transformados con la construcción de control. Pesar varias de las ollas, y cubrir la parte inferior de cada olla para proteger las raíces de la exposición a la luz. Incubar las macetas en una sala de crecimiento climatizado a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche durante cuatro a seis semanas.
Una vez a la semana, pesar varias ollas para determinar la pérdida de agua. Si la pérdida de agua supera los 10 mililitros, suplementar con agua ultrapura para compensar la pérdida. Después de la incubación, limpie las raíces de la perlita y determine los números de nódulos usando un binocular.
Esta técnica se ha utilizado para transformar con éxito pecíolos y segmentos de tallos de Parasponia andersonii con la cepa Agrobacterium AGL1. En primer lugar, los tejidos explants se co-cultivan con Agrobacterium durante dos días. El cultivo prolongado da como resultado una sobrecolonización bacteriana y debe prevenirse.
Unas semanas más tarde, se observan pequeñas microllamadas verdes a lo largo de la superficie original de la herida. Estos calli continúan creciendo y desarrollando uno o más brotes transformados putativamente a las seis a ocho semanas después del inicio de la transformación. Las eficiencias de transformación varían de 10 a 30% para los explantes de tejidos de ramas maduras a 65 a 75% para los explantes de tejidos de ramas jóvenes y de rápido crecimiento.
Los brotes transgénicos se pueden multiplicar a través de la propagación in vitro, lo que da lugar a decenas de brotes en un mes. Estos brotes se pueden colocar en el medio de enraizamiento que inducirá la formación de raíces en aproximadamente dos semanas y las plantas de rendimiento que se pueden utilizar para la experimentación. Al iniciar un experimento de transformación estable, es importante seleccionar ramas sanas como material de origen.
Las líneas transgénicas de Parasponia T0 se propagan in vitro. Por lo tanto, es esencial genotipo completamente Parasponia líneas transgénicas. El establecimiento de Parasponia como modelo experimental permite el análisis comparativo entre dos linajes nodulantes distantemente relacionados, Parasponia y legumbres.
Esto podría identificar redes genéticas conservantes subyacentes a la simbiosis del rizobio. Parasponia también puede ser un modelo valioso para estudiar otros temas de investigación como la formación de madera, el desarrollo de flores bisexuales, o la biosíntesis de metabolitos secundarios específicos de Cannabaceae.
