El ARN pequeño regula muchos procesos biológicos. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos sensibles e imparciales para detectarlos. Nuestro protocolo de protocolo proporciona pasos hacia adelante hacia este objetivo.
Nuestro protocolo sufre de menos problemas de sesgo, que los métodos clásicos de apropiación de bibliotecas de ARN pequeño, y lo que es más importante permite una detección más sensible de dos puntas o meso-RNAs. Como micro-RNAs de plantas. Después de extraer el ARN total de acuerdo con los protocolos estándar.
Pre-ejecutar un 15%TBE gel de urea durante quince minutos a 200 voltios. Y mezcle de cinco a veinte microgramos de ARN total, en un volumen de cinco a quince microlitros, con un volumen igual de tinte de carga de formamida en un tubo de 200 microlitros. Después de cinco minutos a 65 grados Celsius, en un termociclo con una tapa calentada, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo y cargue este último y muestree el gel con al menos un carril entre ellos.
A continuación, ejecute el gel a 200 voltios hasta que el bromofenol haya migrado aproximadamente dos tercios de la longitud del gel. Para cargar el ARN, primero perfore la parte inferior de un tubo de micro centrífuga de 0,5 mililitros libre de nucleasas, con una aguja de calibre 21, y coloque el tubo perforado en un tubo de micro centrífuga de dos mililitros de fondo redondo libre de nucleasa. A continuación, incubar el gel a temperatura ambiente con la mancha de gel de ácido nucleico en agua durante diez a quince minutos, antes de ver el gel en un transiluminador.
Corte el ARN de muestra entre 17 y 29 bandas de escalera de nucleótidos y transfiera la pieza de gel al tubo perforado. Gire hacia abajo el gel en una micro centrífuga a la velocidad máxima durante dos minutos, y retire el tubo de 0,5 mililitros que ahora debería estar vacío. Añadir 300 microlitros de cloruro de sodio sin nucleasas 0,3 al gel triturado y colocar el tubo sobre un rotador durante al menos dos horas a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, transfiera la suspensión de las piezas de gel trituradas a una columna de espín y centrifugar durante dos minutos a la velocidad máxima en la micro centrífuga. Para la eliminación sin esligar de tres adaptadores primos, mezcle a fondo diez microlitros de agua libre de nucleasa con la muestra de ARN extraída, y agregue seis microlitros de tres molares de acetato de sodio con mezcla. Agregue 40 microlitros de cuentas de purificación magnética y 60 microlitros de isopropanol a la muestra con una mezcla exhaustiva.
E incubar la suspensión durante cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque la muestra en un bastidor magnético, hasta que la solución quede clara. Retire el sobrenadante transparente y agregue 180 microlitros de 80% de etanol recién preparado a las perlas.
Después de 30 segundos, retire el etanol y gire brevemente el tubo. Retire cualquier líquido residual que pueda haberse acumulado en la parte inferior del tubo, y deje que las cuentas se sequen durante dos minutos antes de volver a suspender la muestra en 22 microlitros de 10 Tris mililares. Después de dos minutos magnetizar la muestra hasta que la solución aparezca clara.
A continuación, mezclar 20 microlitros de sobrenadante transparente con seis microlitros de tres molares de acetato de sodio en un tubo nuevo, y añadir 40 microlitros de cuentas magnéticas y 60 microlitros de 100% isopropanol. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, magnetice la muestra hasta que la solución parezca transparente, antes de retirar el sobrenadante. Tratar la muestra con 180 microlitros de 80% de etanol recién preparado durante 30 segundos antes de retirar el etanol girando por la muestra, y eliminar cualquier líquido residual que se haya acumulado en la parte inferior del tubo.
Después de permitir que las perlas se sequen durante dos minutos, vuelva a suspenderlas en 10 microlitros de agua libre de nucleasas, durante dos minutos, antes de magnetizar la muestra hasta que la solución quede clara. A continuación, transfiera nueve microlitros de sobrenadante a un nuevo tubo y agregue un microlitro de tampón de ARN 4, y un micrcoliter de agua a la muestra. Para la purificación de gel, ejecutar cinco, diez, y veinte microlitros de producto PCR en un gel nativo 6%TBE durante aproximadamente una hora.
Incubar el gel completo con la mancha de gel de ácido nucleico en agua durante diez a quince minutos, y ver el gel en un transilluminador para permitir la extracción de la banda de biblioteca de 150 pares base. Como es difícil aislar la banda de 150 pares base que los representa, estas son nuestra biblioteca, debido a la presencia de productos secundarios estrechamente migratorios que tendrá que cortar el gel con mucho cuidado. A continuación, aísle el ARN como se acaba de demostrar.
Para la modificación de archivos de secuencia sin procesar, descargue los archivos de secuencia fastq generados durante la ejecución de secuenciación y preforme la demultiplexación con bcl2fastq2 según sea necesario. Quite las secuencias de adaptadores mediante cutodapt y utilice el comando como se ha demostrado. Utilice seqtk como se indica para eliminar los nucleótidos aleatorios terminales en las lecturas de secuencias.
A continuación, utilice el comando awk como se indica, para descartar las secuencias más cortas que 10 nucleótidos. Para asignar las secuencias recortadas, abra miRBase y descargue el archivo fa maduro. Utilice el comando indicado para sustituir los residuos U por residuos de T, para producir una lista completa de todos los micro ARN de la base de datos, procedentes de una variedad de organismos.
Seleccione las secuencias de micro ARN del organismo de interés, con el comando como se indica, y asigne las lecturas al archivo utilizando bowtie2, sin permitir discrepancias. Utilice la herramienta para alinear las lecturas de secuencias con la base de datos, lo que requiere que una lectura se asigne por completo a un micro ARN de la base de datos, sin que se desajusten las discrepancias indicadas. A continuación, utilice el comando para descartar las lecturas que no se alinearon.
Después de cargar cantidades crecientes de una biblioteca amplificada PCR en un gel como se ha demostrado, los productos correspondientes al tamaño esperado se pueden extraer. Después de la elución, la biblioteca purificada se puede comprobar en un chip de electroforesis de gel capilar. Además del producto esperado de 150 pares base, y la proporción creciente de una especie de par base de 130 correspondientes a los dimers de adaptador, se observan típicamente como cantidad creciente de producto PCR se cargan.
Se obtienen resultados similares cuando las bibliotecas de una mezcla de ARN pequeños sintéticos se preparan utilizando reactivos de kits u otros suministros. Para la comparación, se muestran los resultados publicados previamente para la misma pequeña mezcla de ARN. Aquí, se muestra una comparación para el rendimiento del protocolo TS5 con el protocolo TS estándar para la detección de microNas de plantas modificadas O-metales de primera calidad.
También se probó la detección de dos piRNAs modificados o-metales de primera calidad en muestras humanas. Como se observó TS5 preformado significativamente mejor que TS para la detección de dos ARN ometales primos, pero no para ARN no modificados. Prepare bibliotecas de réplicas para cada ejemplo en fechas diferentes.
Por lo general, hay poca variación entre las réplicas hechas simultáneamente, o puede haber una variación sustancial entre las bibliotecas preparadas en diferentes fechas.
