O RNA pequeno regula muitos processos biológicos. Por isso, é importante desenvolver métodos sensíveis e imparciales para detectá-los. Nosso protocolo de protocolo fornece passos em direção a esse objetivo.
Nosso protocolo sofre de menos problemas de viés do que os métodos clássicos de apropriação da biblioteca RNA, e, importante, permite detecções mais sensíveis de dois pinos ou meso-RNAs. Como micro-RNAs de plantas. Depois de extrair RNA total de acordo com os protocolos padrão.
Pré executar um gel de ureia de 15% TBE por quinze minutos a 200 volts. E misture de cinco a vinte microgramas de RNA total, em um volume de cinco a quinze microliter, com um volume igual de corante de carga de formamida em um tubo de 200 microliter. Depois de cinco minutos a 65 graus Celsius, em um termociclador com tampa aquecida, coloque imediatamente os tubos no gelo e carregue este último e prove no gel com pelo menos uma faixa entre eles.
Em seguida, executar o gel a 200 volts até que o bromofenol tenha migrado cerca de dois terços do comprimento do gel. Para carregar o RNA, primeiro puna a parte inferior de um tubo micro centrífuga 0,5 mililitro livre de nuclease, com uma agulha de calibre 21, e coloque o tubo perfurado em um fundo redondo livre de nuclease dois mililitros micro centrífugas tubo. Em seguida, incubar o gel à temperatura ambiente com mancha de gel ácido nucleico na água por dez a quinze minutos, antes de ver o gel em um transilluminador.
Corte a amostra de RNA entre 17 e 29 bandas de escada nucleotídeo, e transfira a peça de gel para o tubo perfurado. Gire o gel em uma micro centrífuga em velocidade máxima por dois minutos e remova o tubo de 0,5 mililitro que agora deve estar vazio. Adicione 300 microlitros de cloreto de sódio nuclease livre de 0,3 molares ao gel esmagado, e coloque o tubo em um rotador por pelo menos duas horas em temperatura ambiente.
No final da incubação, transfira a suspensão das peças de gel esmagadas para uma coluna de giro e centrífuga por dois minutos em velocidade máxima na micro centrífuga. Para a eliminação de três adaptadores prime, misture completamente dez microliters nuclease água livre com a amostra de RNA extraída, e adicione seis microlitros de três acetato de sódio molares com mistura. Adicione 40 microliters de contas de purificação magnética, e 60 microliters de isopropanol à amostra com mistura completa.
E incubar a suspensão por cinco minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, coloque a amostra em um rack magnético, até que a solução fique clara. Remova o supernanato claro e adicione 180 microliters de 80% de etanol recém-preparado às contas.
Após 30 segundos, retire o etanol e gire brevemente o tubo. Remova qualquer líquido residual que possa ter coletado na parte inferior do tubo, e permita que as contas sequem por dois minutos antes de suspender a amostra em 22 microlitrais de 10 mililitros Tris. Após dois minutos magnetize a amostra até que a solução pareça clara.
Em seguida, misture 20 microlitadores de supernascer claro com seis microlitadores de três acetatos de sódio molar em um novo tubo, e adicione 40 microliters de contas magnéticas e 60 microliters de 100% isopropanol. Após cinco minutos em temperatura ambiente, magnetize a amostra até que a solução pareça clara, antes de remover o sobrenatante. Trate a amostra com 180 microliters de 80% de etanol recém-preparado por 30 segundos antes de remover o etanol girando para baixo da amostra, e remover qualquer líquido residual que tenha se acumulado na parte inferior do tubo.
Depois de permitir que as contas sequem por dois minutos, suspenda-as em 10 microlitadores de água livre de nuclease, por dois minutos, antes de magnetizar a amostra até que a solução fique clara. Em seguida, transfira nove microlitadores de supernascer para um novo tubo e adicione um microliter de tampão ligase T4 RNA, e um micrcoliter de água para a amostra. Para purificação de gel, execute cinco, dez e vinte microliters de produto PCR em um gel nativo de 6% TBE por cerca de uma hora.
Incubar o gel completo com mancha de gel ácido nucleico na água por dez a quinze minutos, e ver o gel em um transilluminador para permitir a extração da banda de biblioteca de 150 pares de base. Como é difícil isolar a banda de 150 bases que os representa, estas são a nossa biblioteca, devido à presença de produtos laterais que você precisará cortar o gel com muito cuidado. Em seguida, isole o RNA como apenas demonstrado.
Para modificação de arquivo de sequência bruta, baixe os arquivos de sequência de fastq gerados durante a execução de sequenciamento e desmultiplexing pré-formado com bcl2fastq2, conforme necessário. Remova as sequências do adaptador usando cutodapt e use o comando como demonstrado. Use seqtk conforme indicado para remover os nucleotídeos aleatórios do terminal nas sequências.
Em seguida, use o comando awk como indicado, para descartar as sequências mais curtas que 10 nucleotídeos. Para mapear as sequências aparadas, abra o miRBase e baixe o arquivo fa maduro. Use o comando como indicado para substituir os resíduos de U por resíduos T, para produzir uma lista completa de todos os micro RNAs no banco de dados, originários de uma variedade de organismos.
Selecione as sequências de micro RNA do organismo de interesse, com o comando como indicado, e mapeie as leituras para o arquivo usando bowtie2, não permitindo incompatibilidades. Use a ferramenta para alinhar as sequências no banco de dados, exigindo que um mapa de leitura inteiramente para um micro RNA do banco de dados, com quaisquer incompatibilidades conforme indicado. Em seguida, use o comando para descartar as leituras que não se alinharam.
Depois de carregar quantidades crescentes de uma biblioteca amplificada pcr em um gel como demonstrado, os produtos correspondentes ao tamanho esperado podem ser extraídos. Após a elução, a biblioteca purificada pode ser verificada em um chip de eletroforese de gel capilar. Além do esperado produto de par de base de 150, e a proporção crescente de 130 espécies de par de base correspondentes aos dimers adaptadores, são tipicamente observadas à medida que a quantidade crescente de produto PCR é carregada.
Resultados semelhantes são obtidos quando bibliotecas de uma mistura de rnas pequenas sintéticas são preparadas usando reagentes de kits ou outros suprimentos. Para comparação, são mostrados resultados publicados anteriormente para o mesmo pequeno mix de RNA. Aqui, é mostrada uma comparação para o desempenho do protocolo TS5 com o protocolo TS padrão para a detecção de micro RNAs de plantas modificadas O-methal principais.
A detecção de dois piRNAs modificados O-methal em amostras humanas também foi testada. Como observado, o TS5 pré-formado foi significativamente melhor que o TS para a detecção de dois RNAs O-methal primos, mas não para RNAs não modificados. Prepare bibliotecas de réplica para cada amostra em datas diferentes.
Geralmente há pouca variação entre as réplicas feitas simultaneamente, ou pode haver variação substancial entre bibliotecas preparadas em diferentes datas.
