Il piccolo RNA regola molti processi biologici. È quindi importante sviluppare metodi sensibili e imparziali per individuarli. Il nostro protocollo fornisce passi avanti verso questo obiettivo.
Il nostro protocollo soffre di meno problemi di bias, rispetto ai classici metodi di appropriazione della piccola libreria di RNA, e soprattutto consente rilevamenti più sensibili di due prong o meso-RNA. Come i micro-RNA vegetali. Dopo aver estratto l'RNA totale secondo protocolli standard.
Pre-eseguire un gel di urea TBE 15%TBE per quindici minuti a 200 volt. E mescolare da cinque a venti microgrammi di RNA totale, in un volume da cinque a quindici microliter, con un volume uguale di colorante di carico formamide in un tubo da 200 microliter. Dopo cinque minuti a 65 gradi Celsius, in un termociclo con coperchio riscaldato, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio e caricare quest'ultimo e campionare sul gel con almeno una corsia tra di loro.
Quindi eseguire il gel a 200 volt fino a quando il bromofenolo non è migrato circa due terzi della lunghezza del gel. Per caricare l'RNA, prima forare il fondo di un tubo di micro centrifuga senza nucleasi da 0,5 millilitri, con un ago calibro 21, e posizionare il tubo perforato in un fondo rotondo privo di nucleasi due tubi di micro centrifuga millilitro. Successivamente, incubare il gel a temperatura ambiente con la macchia di gel acido nucleico in acqua per dieci o quindici minuti, prima di visualizzare il gel su un transilluminatore.
Ritagliare l'RNA campione tra 17 e 29 bande di scale nucleotidiche e trasferire il pezzo di gel nel tubo perforato. Far girare il gel in una micro centrifuga alla massima velocità per due minuti e rimuovere il tubo da 0,5 millilitri che ora dovrebbe essere vuoto. Aggiungere 300 microlitri di cloruro di sodio privo di nucleasi 0,3 al gel frantumato e posizionare il tubo su un rotatore per almeno due ore a temperatura ambiente.
Alla fine della fine dell'incubazione, trasferire la sospensione dei pezzi di gel frantumato su una colonna di spin e centrifugare per due minuti alla massima velocità nella micro centrifuga. Per l'eliminazione di tre adattatori primi non legati, mescolare accuratamente dieci microlitri di acqua priva di nucleasi con il campione di RNA estratto e aggiungere sei microlitri di tre molari acetato di sodio con miscelazione. Aggiungere 40 microlitri di perline di purificazione magnetica e 60 microlitri di isopropanolo al campione con miscelazione accurata.
E incubare la sospensione per cinque minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, posizionare il campione su un rack magnetico, fino a quando la soluzione diventa chiara. Rimuovere il supernatante chiaro e aggiungere 180 microlitri di etanolo appena preparato all'80% alle perline.
Dopo 30 secondi, rimuovere l'etanolo e ruotare brevemente il tubo. Rimuovere il liquido residuo che potrebbe aver raccolto nella parte inferiore del tubo e lasciare asciugare le perline per due minuti prima di sospendere di nuovo il campione in 22 microlitri di Tris da 10 millimolare. Dopo due minuti magnetizzare il campione fino a quando la soluzione appare chiara.
Successivamente, mescolare 20 microlitri di supernatante trasparente con sei microlitri di tre acetati di sodio molare in un nuovo tubo e aggiungere 40 microlitri di perline magnetiche e 60 microlitri di isopropanolo al 100%. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, magnetizzare il campione fino a quando la soluzione appare limpida, prima di rimuovere il supernatante. Trattare il campione con 180 microlitri di 80%etanolo appena preparato per 30 secondi prima di rimuovere l'etanolo che fila il campione e rimuovere qualsiasi liquido residuo accumulato nella parte inferiore del tubo.
Dopo aver permesso alle perline di asciugarsi per due minuti, sospenderle di nuovo in 10 microlitri di acqua priva di nucleasi, per due minuti, prima di magnetizzare il campione fino a quando la soluzione non diventa chiara. Quindi, trasferire nove microlitri di supernatante su un nuovo tubo e aggiungere un microlitro di tampone di ligasi dell'RNA T4 e un micrcoliter di acqua al campione. Per la purificazione del gel, eseguire cinque, dieci e venti microlitri di prodotto PCR su un gel nativo 6%TBE per circa un'ora.
Incubare il gel completato con macchia di gel acido nucleico in acqua per dieci-quindici minuti e visualizzare il gel su un transilluminatore per consentire l'estrazione della banda della libreria di 150 coppie di basi. Poiché è difficile isolare la banda di 150 coppie di basi che li rappresenta, queste sono la nostra libreria, a causa della presenza di prodotti laterali strettamente migrati che dovrai tagliare il gel con molta attenzione. Quindi isolare l'RNA come appena dimostrato.
Per la modifica non completa dei file di sequenza, scaricare i file di sequenza fastq generati durante l'esecuzione della sequenza e preformare la demultiplexing con bcl2fastq2, se necessario. Rimuovere le sequenze di adattatori utilizzando cutodapt e utilizzare il comando come illustrato. Utilizzare seqtk come indicato per rimuovere i nucleotidi casuali terminali nelle letture delle sequenze.
Quindi utilizzare il comando awk come indicato, per scartare le sequenze più corte di 10 nucleotidi. Per mappare le sequenze tagliate, aprire miRBase e scaricare il file fa maturo. Utilizzare il comando indicato per sostituire i residui di U con residui di T, per fornire un elenco completo di tutti i microRNA della base di dati, provenienti da una varietà di organismi.
Selezionare le sequenze di micro RNA dell'organismo di interesse, con il comando come indicato, e mappare le letture al file utilizzando bowtie2, senza lasciare disallineamenti. Utilizzare lo strumento per allineare le letture delle sequenze al database, richiedendo che una lettura sia mappata interamente a un micro RNA del database, senza alcuna mancata corrispondenza come indicato. Utilizzare quindi il comando per ignorare le letture che non si sono allineate.
Dopo aver caricato quantità crescenti di una libreria amplificata PCR su un gel come dimostrato, è possibile estrarre i prodotti corrispondenti alla dimensione prevista. Dopo l'eluizione, la libreria purificata può essere controllata su un chip di elettroforesi a gel capillare. Oltre al prodotto di coppia di base previsto di 150 e alla proporzione crescente di una specie di coppia di base 130 corrispondente ai dimeri dell'adattatore, si osservano in genere come quantità crescente di prodotto PCR caricato.
Risultati simili si ottengono quando le librerie di un mix di piccole RTA sintetiche sono preparate utilizzando reagenti da kit o altre forniture. Per confronto, vengono mostrati i risultati pubblicati in precedenza per lo stesso piccolo mix di RNA. Qui viene mostrato un confronto per le prestazioni del protocollo TS5 con il protocollo TS standard per il rilevamento di microRNA vegetali modificati o-methal umani e due microRNA vegetali modificati o-methal.
È stato inoltre testato il rilevamento di due piRNA modificati o-methal primi in campioni umani. Come osservato, il TS5 preformato significativamente migliore del TS per il rilevamento di due RNA O-methal prime, ma non per gli RNA non modificati. Preparare le librerie di replica per ogni esempio in date diverse.
Di solito c'è poca variazione tra le repliche fatte contemporaneamente, o ci possono essere variazioni sostanziali tra le librerie preparate in date diverse.
