작은 RNA는 많은 생물학적 과정을 조절합니다. 따라서 민감하고 편견없는 방법을 개발하여 감지하는 것이 중요합니다. 당사의 프로토콜 프로토콜은 이 목표를 향한 단계를 제공합니다.
우리의 프로토콜은 고전적인 작은 RNA 라이브러리 수용 방법보다 더 적은 편견 문제로 고통받고 있으며, 중요한 것은 두 갈래 또는 메소 RNA의 보다 민감한 검출을 허용합니다. 식물 마이크로 RNA와 같은. 표준 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출한 후.
200볼트에서 15%TBE 우레아 젤을 15%로 미리 실행합니다. 그리고 총 RNA의 5~20 마이크로그램을 5~15마이크로리터 부피로 혼합하고, 200 마이크로리터 튜브에 동일한 양의 포름아미드 로딩 염료를 혼합합니다. 섭씨 65도에서 5분 후, 가열된 뚜껑이 있는 열순환기에서 튜브를 얼음에 즉시 놓고 후자를 얼음에 싣고 둘 사이에 적어도 하나의 차선으로 젤에 샘플을 넣습니다.
그런 다음 브로모페놀이 젤 길이의 약 3분의 2를 이동할 때까지 200볼트에서 젤을 실행합니다. RNA를 로드하려면 먼저 21 게이지 바늘로 뉴클레아제 무료 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥을 뚫고 뉴클레아제 프리 라운드 하단 2 밀리리터 마이크로 원심분리관에 천공 된 튜브를 배치합니다. 다음으로, 핵산 젤 얼룩을 10분에서 15분 동안 물에 담근 후, 일루미너에서 젤을 볼 수 있다.
17과 29 뉴클레오티드 래더 대역 사이의 샘플 RNA를 잘라내고, 겔 조각을 천공 된 튜브로 옮킨다. 2 분 동안 최대 속도로 마이크로 원심 분리기에서 젤을 회전시키고 이제 비어있어야하는 0.5 밀리리터 튜브를 제거하십시오. 300 마이크로리터의 뉴클레아제 프리 0.3 어금니 나트륨염화 나트륨을 분쇄된 젤에 넣고 실온에서 적어도 2시간 동안 회전자에 튜브를 놓습니다.
인큐베이션의 끝에, 분쇄 된 젤 조각 서스펜션을 스핀 컬럼으로 옮기고, 원심분리기는 마이크로 원심분리기에서 최대 속도로 2 분 동안 전달합니다. 3개의 프라임 어댑터 제거를 위해, 추출된 RNA 샘플과 10개의 마이크로리터 뉴클레아제 프리 워터를 철저히 혼합하고, 3개의 어료 나트륨 아세테이트의 6마이크로리터를 혼합과 첨가한다. 40 마이크로리터의 자기 정화 비드, 60 마이크로리터의 이소프로판올을 철저히 혼합하여 시료에 넣습니다.
그리고 실온에서 5 분 동안 서스펜션을 인큐베이션하십시오. 인큐베이션의 끝에서, 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자기 랙에 놓습니다. 투명 상체를 제거하고, 갓 준비된 80% 에탄올 180 마이크로리터를 비드에 넣습니다.
30초 후, 에탄올을 제거하고 튜브를 잠시 회전시다. 튜브 의 바닥에 수집 할 수있는 잔류 액체를 제거하고, 10 밀리머 트리의 22 마이크로 리터에서 샘플을 다시 중단하기 전에 구슬이 2 분 동안 건조 할 수 있도록. 2분 후 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자화합니다.
다음으로, 명확한 초판제 20마이크로리터를 새로운 튜브에 3개의 어금니 나트륨 아세테이트 6마이크로리터와 혼합하고, 40마이크로리터의 마그네틱 비드와 100% 이소프로파놀60 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 5분 후, 상체를 제거하기 전에 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자화합니다. 시료를 30초 동안 신선하게 준비한 80%에탄올 180마이크로리터로 샘플을 치료한 후, 에탄올이 시료를 아래로 회전시키고 튜브 바닥에 축적된 잔류 액체를 제거합니다.
구슬이 2분 동안 건조되도록 허용한 후, 용액이 명확해질 때까지 시료를 자화하기 전에 2분 동안 10마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터에서 다시 중단합니다. 그런 다음, 새로운 튜브에 슈퍼나탄의 9 마이크로리터를 전송하고 T4 RNA 리게아제 버퍼의 1개의 마이크로리터, 그리고 1개의 물 미저콜리터를 샘플에 추가합니다. 젤 정제를 위해, 약 1 시간 동안 네이티브 6%TBE 젤에 PCR 제품의 5, 10 및 20 마이크로리터를 실행합니다.
완성된 젤을 10~15분 동안 물에 핵산 젤 얼룩으로 배양하고, 150개의 베이스 페어 라이브러리 밴드를 추출할 수 있도록 트릴루미너에 겔을 본다. 그들을 대표하는 150 베이스 페어 밴드를 분리하기가 어렵기 때문에, 이들은 밀접하게 마이그레이션 측면 제품의 존재로 인해 매우 신중하게 젤을 잘라해야합니다 우리의 라이브러리입니다. 그런 다음 방금 입증된 대로 RNA를 분리합니다.
원시 시퀀스 파일 수정의 경우 시퀀싱 실행 중에 생성된 fastq 시퀀스 파일을 다운로드하고 필요에 따라 bcl2fastq2로 디멀티플렉싱을 수정합니다. cutodapt를 사용하여 어댑터 시퀀스를 제거하고 설명된 대로 명령을 사용합니다. 서열에서 임의뉴클레오티드를 제거하기 위해 지시된 바와 같이 seqtk를 사용하여 읽는다.
그런 다음 표시된 대로 awk 명령을 사용하여 10 개 이상의 뉴클레오티드보다 짧은 서열을 폐기한다. 트리밍 된 시퀀스를 매핑하려면 miRBase를 열고 성숙한 FA 파일을 다운로드하십시오. U 잔류물을 T 잔류물로 대체하기 위해 지시된 명령을 사용하여 다양한 유기체에서 유래한 데이터베이스의 모든 마이크로 RNA의 전체 목록을 산출합니다.
관심 있는 유기체의 마이크로 RNA 서열을 선택하여 명령과 함께, bowtie2를 사용하여 판독을 파일에 매핑하여 불일치를 허용하지 않습니다. 이 도구를 사용하여 시퀀스가 읽기를 데이터베이스에 정렬하여 읽기가 데이터베이스의 마이크로 RNA에 전적으로 매핑되도록 하고, 표시된 바와 같이 불일치를 제외해야 합니다. 그런 다음 명령을 사용하여 정렬되지 않은 읽기를 삭제합니다.
입증된 바와 같이 PCR 증폭 라이브러리의 양을 겔에 적재한 후, 예상 된 크기에 대응하는 제품을 추출할 수 있다. 용출 후, 정제 된 라이브러리는 모세관 젤 전기 포근 칩에 검사 할 수 있습니다. 예상 150개의 염기 쌍 제품 외에도 어댑터 디머에 대응하는 130개의 기본 쌍 종의 비율이 증가하고 있으며, 일반적으로 PCR 제품의 양이 증가함에 따라 적재되는 것으로 관찰된다.
유사한 결과는 합성 작은 RNA의 혼합에서 라이브러리가 키트, 또는 다른 공급에서 시약을 사용하여 제조 될 때 얻을 수 있습니다. 비교를 위해, 동일한 작은 RNA 혼합에 대한 이전에 발표된 결과가 표시됩니다. 여기서, 수정되지 않은 인간 및 2개의 프라임 O-methal 수정 식물 마이크로 RNA의 검출을 위한 표준 TS 프로토콜과 프로토콜 TS5의 성능을 비교하는 것이 도시된다.
인간 샘플에서 두 개의 프라임 O-methal 수정 된 piRNAs의 검출도 테스트하였다. 관찰된 TS5는 두 개의 프라임 O-methal RNA의 검출을 위해 TS보다 훨씬 더 잘 형성되었지만 수정되지 않은 RNA는 아닙니다. 서로 다른 날짜에 각 샘플에 대한 복제 라이브러리를 준비합니다.
일반적으로 동시에 만든 복제중 에는 약간의 변화가 있거나 서로 다른 날짜에 준비된 라이브러리 간에 상당한 변화가 있을 수 있습니다.
