Este método permite al usuario generar un perfil de contenido de ADN nuclear de hepatocitos a partir de secciones de tejido 2D para el estudio del desarrollo hepático, regeneración y enfermedad crónica. Este enfoque automatizado de alto rendimiento se puede aplicar a todas las secciones de tejido hepático 2D, proporcionando una lectura calibrada internamente de la ploidía nuclear para todos los núcleos circulares simples de hepatocitos. Los cambios en la ploidía nuclear de hepatocitos se asocian con el envejecimiento, enfermedad hepática crónica y cáncer.
Esta técnica proporciona un medio simple para perfilar la ploidía nuclear en especímenes hepáticos fijos o crioconservados. Los métodos de perfilado de ploidy in situ tienen un potencial considerable como herramientas de investigación y clínicas para rastrear la progresión de la enfermedad hepática, ya que no requieren dessegregación de tejido ni acceso a material fresco. Después de cosechar la muestra de tejido hepático murino, incruste el lóbulo hepático en un medio de temperatura de corte óptimo lleno de criomodo e inmediatamente coloque el molde en hielo seco para asegurar una congelación rápida.
Para obtener rebanadas de la muestra de lóbulo hepático congelado, se sectione la muestra con un grosor de seis micrómetros, colocando una diapositiva recubierta de poliamida etiquetada sobre cada muestra durante cinco segundos para dejar que cada muestra se pegue a la diapositiva. Cuando se hayan recogido todas las rodajas, deje que las muestras se equilibren durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente antes del inmunoetiquetado. Al final del equilibrio, fijar las secciones del tejido en una campana de humo con un mililitro de 4%paraformaldehído en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la fijación, enjuague los portaobjetos con tres lavados de tres minutos en PBS con agitación suave. Después del último lavado, seque el área alrededor de cada sección de tejido y use una pluma hidrófoba para dibujar un círculo alrededor de cada muestra. Para permeabilizar las muestras, trate las secciones con un tensioactivo no iónico del 0,5% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave las muestras durante tres minutos en PBS dos veces con agitación suave como se ha demostrado antes de bloquear la unión no específica con una solución filtrada de 1%albúmina sérica bovina, 5% de suero de caballo y 0,2% tensioactivo no iónico en PBS durante al menos una hora a temperatura ambiente. A continuación, incubar los portaobjetos con el anticuerpo HHF4-alfa diluido en tampón de bloqueo durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara de tinción húmeda protegida de la luz. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos cuatro veces en PBS con agitación suave antes de la incubación con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado y Hoechst diluido en albúmina sérica 1%bovina filtrada y 0.2%surfactante no iónico en PBS durante dos horas a temperatura ambiente en una cámara de tinción húmeda protegida de la luz.
Al final de la incubación, lave los portaobjetos cuatro veces como se ha demostrado, seguido de dos lavados de tres minutos en agua doble destilada con agitación suave. Después del último lavado, monte las muestras con dos gotas de medio de montaje de fluorescencia en un cubreobjetos y aplique una presión suave según sea necesario para eliminar cualquier burbuja. A continuación, compruebe las diapositivas con un microscopio de fluorescencia convencional para garantizar una buena fijación e inmunoetiquetado.
Para la adquisición de imágenes de fluorescencia, establezca los parámetros en una plataforma de imágenes de alto contenido para adquirir imágenes de fluorescencia utilizando la excitación adecuada para los fluoróforos utilizados. A continuación, escanee muestras para adquirir imágenes suficientes para obtener una cobertura completa de la sección del tejido. Al final de la exploración, ajuste los parámetros de segmentación nuclear del software para asegurarse de que los núcleos están perfectamente segregados y modifique la intensidad del umbral para garantizar una gama óptima de los hepatocitos positivos HNF4-alfa y las células no parénquimales HNF4-alfa negativas.
Para la cuantificación nuclear, establezca el área nuclear en micrómetros cuadrados sobre la base de la tinción Hoechst, la principal intensidad nuclear de Hoechst, el factor de alargamiento nuclear, el índice medio de redondez nuclear, el estado HNF4-alfa y las coordenadas nucleares X, Y basadas en el centro de gravedad. Para realizar un análisis de ploidía nuclear de hepatocitos, primero descargue e instale el programa de análisis de cuantificación de ploidy. En MATLAB, vaya a la pestaña Aplicación de la tira de herramientas y haga clic en Instalar aplicación.
Abra el programa de instalación de la aplicación de ML de la aplicación Ploidy. Aparecerá un mensaje para confirmar la instalación correcta. En cada archivo de análisis de datos, incluya una hoja con el nombre de Medidas de celda, que contenga todos los datos necesarios para el análisis de ploidy establecidos en columnas como se indica.
Para cada condición experimental, proporcione un conjunto de datos de control que se utilizará para calcular el control interno para dos a cuatro calibraciones de ploidey nuclear N. Para réplicas biológicas, almacene cada hoja de cálculo en su propia carpeta, nombrando los prefijos de carpeta de forma incremental. A continuación, inicie la aplicación Ploidy.
Aparecerá la interfaz gráfica de usuario de la aplicación Ploidy. Haga clic en el botón Ruta de acceso a datos de control para navegar a la carpeta en la que residen las réplicas de datos de control. Esta ruta de datos aparecerá en la interfaz.
En Prefijo de carpeta, escriba el nombre que se va a asignar a los archivos de salida. Haga clic en el botón Ruta a otros datos y vaya a la carpeta en la que residen las réplicas de datos comparativos. Esta ruta de datos aparecerá en la interfaz.
A continuación, haga clic en Ejecutar. Una vez completado el análisis, la barra de estado leerá Análisis completado. Después del inmunoetiquetado, es importante comprobar todos los portaobjetos mediante microscopía de fluorescencia convencional para confirmar que se ha obtenido una fijación y tinción de buena calidad.
El frotis o el desenfoque del tinte Hoechst puede indicar una fijación inadecuada o degradación de la muestra antes de la fijación. La segregación nuclear y los parámetros del umbral HNF4-alfa deben optimizarse cuidadosamente antes del análisis automático de imágenes para reflejar ampliamente el patrón visual de la inmunosumanidad observada por la microscopía de fluorescencia. Después del análisis de la imagen, los datos deben reflejar el creciente número de células no parénquimas y la pequeña, pero significativa, reducción en los números de núcleos positivos HNF4-alfa dentro del hígado con lesión DDC.
En hígados de control sano, aproximadamente el 63% de los núcleos positivos HNF4-alfa exhiben una morfometría circular simple. La comparación de la ploidy nuclear relativa entre los grupos de control y los grupos tratados con DDC debe reflejar una pérdida significativa de núcleos de hepatocitos 2C y 4C con lesiones junto con un aumento del número de células superiores a 8C. La información posicional relativa de cada subgrupo de ploidy se puede interrogar recuperando la ubicación 2D de subconjuntos de hepatocitos particulares dentro del software de análisis de imágenes de alto contenido.
El inmunoetiquetado con anticuerpos adicionales, como Ki-67, se puede realizar para evaluar la replicación celular y los datos de morfometría nuclear de hepatocitos se pueden interrogar aún más para complementar el análisis de la ploidey. El perfil de ploidy de todo el tejido generado por este método describe el contenido mínimo de ADN para todos los núcleos de hepatocitos circulares, pero no discrimina entre las células mononucleares y los hepatocitos binucleares. El método puede adaptarse potencialmente para tener en cuenta parámetros como el perímetro de la célula, para facilitar la identificación de las células binuclears y proporcionar una lectura adicional de la ploidy celular.
