El cultivo celular neuronal primario es un sistema modelo ideal para estudiar las neuronas disociadas en cultivo in vitro. La ventaja de usar este método es ser capaz de mantener las características celulares de las células disociadas, tales como mecanismos, funciones y condiciones in vitro de morfología durante unas semanas lo más cerca posible de la condición in vivo. Coloque los resbalones de la cubierta redonda en una placa de 24 pozos debajo del gabinete de bioseguridad.
Agregue 90 microlitros de poli-L-ornitina en cada resbalón de cubierta. Cierre la tapa y coloque suavemente la placa en la incubadora de 37 grados durante dos días. Preparar el medio de cultivo y el medio de siembra y mantenerlos a cuatro grados centígrados.
Prepare la solución de trippsina de trabajo en DMEM/F12 y manténgala en cuatro grados. Coloque el medio de cultivo y el medio de siembra en la incubadora a 37 grados. Saque la placa de 24 pozos de la incubadora.
Lave los resbalones de la cubierta tres veces con agua doble destilada. Deje los resbalones de la cubierta durante al menos dos horas para secar por completo. Prepare tres platos Petri llenos de PBS frío, tres platos Petri llenos de HBSS frío y cinco platos Petri llenos de medio de disección fría sobre hielo.
Exélute los cuernos uterinos y lávelos en PBS frío tres veces sobre hielo. A partir de aquí todos los pasos deben llevarse a cabo sobre hielo para minimizar el daño tisular. Después del último paso de lavado, separe a los cachorros del útero en HBSS y transfieralos al medio de disección en frío.
En el medio de disección, decapitar a los cachorros con tijeras. Abra el calvario desde el foramen magnum hasta el borde inferior de la cavidad orbital. Usando un par de fórceps finos, retire la base del cráneo y pele el cráneo del cerebro.
Retirar cuidadosamente las meninges del cerebelo a partir de la superficie lateral del pedúnculo y pons cerebeloso medio. Corta ambos pedúnculos cerebelosos y separa el cerebelo del resto del cerebro. Coloque inmediatamente la cerebella recogida en un tubo cónico estéril de 15 ml lleno de DMEM/F12 sobre hielo.
Centrifugar el tubo a 1.000 g a cuatro grados durante un minuto en DMEM/F12. Repita esto tres veces, retirando cada vez suavemente el sobrenadante con una pipeta y re-suspendiendo el pellet en DMEM/F12 fresco. Agregue dos mililitros de trippsina precaleada y pipetee suavemente para mezclarlos.
Coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados durante 12 minutos. Después de la incubación, lleve el tubo al armario de seguridad y agregue 10 ml de DMEM/F12 para inactivar la tripina. Centrifugar la mezcla a 1.200 g durante cinco minutos.
Desechar el sobrenadante y resuspend en medio fresco seguido de centrifugación tres veces. Pre-mojar una pipeta de plástico estéril con DMEM/F2. Añadir 3,5 mililitros de solución de trabajo DNAse al mismo tubo.
Triturar el tejido con una pipeta varias veces hasta que el líquido alcance un color lechoso homogéneo. Añadir 10 ml de DMEM/F12 frío a la mezcla y proceder a la centrífuga. Centrifugar la muestra a 1.200 g a cuatro grados durante cinco minutos.
Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Retire el medio de siembra de la incubadora. Agregue 500 microlitros de medio de siembra precalentado y mezcle bien con la pipeta.
Cuente las células usando un hemocicómetro. Diluir la suspensión celular con un medio de siembra a una densidad de 500.000 células por mililitro. Añadir 90 microlitros de la mezcla a cada pozo en el centro del cubreobjetos.
Coloque la placa en la incubadora a 37 grados durante tres a cuatro horas. Después de la incubación, añadir 500 microlitros de medio de cultivo precalentado en cada pocód en cada pocód en. Sustituya la placa en la incubadora a 37 grados.
Después de siete días, sustituya el antiguo medio por medio de cultivo fresco II.Prepare una placa separada de 24 pozos con la organización numérica correspondiente y agregue 100 microlitros de PFA 4% a cada pozo. Después de los días deseados en el cultivo, retire suavemente los resbalones de la cubierta de los pozos de la placa de cultivo original y colóquelos en los pozos correspondientes de la placa PFA descrita en el paso anterior. Añadir PFA a los pozos para sumergir completamente los resbalones de la cubierta.
Mantenga la placa PFA a cuatro grados durante 30 a 120 minutos. Después de la incubación, restaure la placa a temperatura ambiente. Lave suavemente los resbalones de la cubierta con PBS durante cinco minutos tres veces.
La figura dos del texto muestra el cultivo de células cerebelosas a partir de E18. La inmunofluorescencia para la calbinadina muestra las neuronas de Purkinje con extensiones axonales por tres días in vitro. Por siete a 10 días in vitro, los procesos dendríticos son evidentes.
A los 21 días, las ramas dendríticas complejas están presentes. La figura tres del texto muestra cultivos celulares cerebelosos a partir de varios días embrionarios. la detección de inmunofluorescencia de la calbinada muestra las neuronas purkinje con axones tempranos sólo después de 18 días in vitro.
Los cultivos de neurona purkinje comenzaron en E14 y E15 desarrollarán dendritas, pero nunca tan complejas como las que se desarrollan cuando E18 es el punto de partida. La figura cuatro del texto muestra que diferentes tipos de células se desarrollan a partir de cultivos E18 después de 21 días in vitro. La inmunofluorescencia verde de Calbindin muestra las neuronas Purkinje.
La inmunofluorescencia roja para la parvalbumina en B y C muestra interneurones inhibitorios. La inmunofluorescencia roja para el canal cerrado por voltaje de sodio en E y F muestra las neuronas de gránulos. El presente protocolo es rentable y fácil de llevar a cabo.
Al final de este video, usted será capaz de recoger y cultivar neuronas cerebelosas y arreglarlos en los DIVs deseados.
