El objetivo de este protocolo de vídeo es establecer una fuente y un protocolo eficiente para el aislamiento y cultivo de células madre neuronales del ratón embrionario. Hola, soy Maryam Sadeghi-Zadeh. Soy estudiante de Maestría en Biología Celular y Molecular en el Instituto Royan.
Hoy mi colega y yo queremos mostrarles cómo cosechar células madre neurales de 13 eminencia gangliónicas de ratón embrionario. Hola, soy Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Soy estudiante de Maestría en Biología Celular y Molecular en el Departamento de Células Madre del Royan Institute for Biotechnology.
Hola, soy Reza Dehghani-Varnamkhasti. También estoy estudiando Biología Celular y Molecular en el Instituto Royan. Los procedimientos quirúrgicos incluyen la recolección de cada 13 embriones de ratón del útero.
Corte de la parte frontal del fontanel del embrión con una punta de aguja doblada que extrae el cerebro del cráneo. Micro-disección del cerebro aislado para cosechar la eminencia gangliónica. Disociación del tejido cosechado en un medio de células madre neurales para obtener una suspensión de una sola célula.
Y finalmente, enchapar las células en un cultivo de suspensión para generar células nerviosas. Limpiar y desinfectar la piel del área del abdomen rociando con 70%etanol. Controla la piel hacia arriba del abdomen y luego corta la piel y subraya el facial con tijeras para descubrir la cavidad abdominal y los cuernos uterinos.
Retire los cuernos uterinos que contienen los embriones mediante tijeras y transfiéralos a un tubo cónico de 50 ml que contenga 25 ml de tampón HEPES MEM frío. Coloque el tubo cónico debajo de la capucha de flujo laminal. Abra la tapa debajo del capó.
Saque los cuernos uterinos del tubo y enjuague tres veces con suficiente volumen del tampón HEPES MEM frío para eliminar los desechos y la sangre. Transfiera el tejido uterino a una placa petri de 10 cm que contenga de 7 a 10 ml de tampón HEPES MEM frío. Abra los cuernos uterinos con tijeras finas y transfiera embriones a un nuevo plato que contenga de 7 a 10 ml de tampón HEPES MEM frío.
Ahora ponga el plato de 10 cm con embriones bajo el microscopio de disección para la operación de micro-disección. Doble la punta de una aguja de jeringa empujando su punta sobre un mango de hoja de bisturí de acero. Doble la punta de la aguja hasta que la punta esté doblada en un ángulo de 70 a 90 grados.
Compruebe la punta de la aguja debajo del microscopio de disección para ver la curvatura en la punta de la aguja. Naturalmente, los embriones tienen una posición lateral en esto. Sin cambiar su posición, sostuvo el cuello y el cuerpo del embrión con fórceps finos y luego inserte la parte doblada de la aguja profundamente en la parte delantera del fontanel de la cabeza del embrión.
Habría un pequeño sangrado o un coágulo de sangre allí. Mueva la punta de la aguja superficialmente mientras la parte doblada está dentro de la protuberancia hacia la frente y luego hacia la parte posterior de la cabeza. Asegúrese de cortar a través de la piel y el cráneo, y no dañar el cerebro subyacente.
Empuje la piel con la punta de la aguja lateralmente para descubrir el cerebro. Inserte la aguja desde el lado lateral de la piel hasta la parte inferior del marco desde el lado lateral de la piel hasta el área debajo del cerebro. Y luego quitar el cerebro de este cuero cabelludo empujándolo para salir del cráneo diseccionado.
La eminencia gangliónica se muestra claramente en vídeo con sus partes mediales y laterales. Mantuvo el cerebro estable usando los fórceps de cuidado y luego usando microscisores para cortar la corteza de cada hemisferio para exponer la eminencia gangliónica. Sostuvo el cerebro y colocaba la eminencia gangliónica diseccionada en el tubo centrífugo de 15 ml que contiene medios de células madre neurales.
Repita este procedimiento hasta que todo el cerebro haya sido micro-diseccionado. Corte la eminencia gangliónica diseccionada colocando la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo y pipetee la suspensión hacia arriba y hacia abajo durante 2 5 veces para romper el tejido para obtener una suspensión de una sola célula. Centrifugar la suspensión a 110 g durante 5 minutos.
Retire el sobrenadante y resusppend las células en 1 ml de tubo 0.05% en EDTA. Incubar la suspensión celular en un grado de 37 grados Centígrados durante 10 minutos. Y luego añadir un volumen equivalente de inhibidor de la trippsina de soja para detener la actividad de la trippsina.
Pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la trippsina ha sido totalmente inactivada. Centrifugar la suspensión celular a 110 g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y resusppend las células en 1 ml de medio de células madre neurales completas y cuente el número de células.
Placar las células en el medio de células madre neurales en el tamaño adecuado matraz de cultivo de tejido. Transfiera 5 ml de 2T25, 20 ml a T75 y 40 ml a matraces T175. Las neuroesferas aparecerán después de 3 días de cultivo a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5%CO2.
Para aspirar el cultivo de las neuroesferas, transfiera el medio con neuroesferas suspendidas a la centrífuga a centrifugar a 110 g durante 5 minutos, y luego deseche el sobrenadante. A 1 ml de 0.05%trypsin EDTA e incubar a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Luego inactivar la tripina usando inhibidor de la tyrpsina de soyben y pipetear las neuroesferas suavemente hacia arriba y hacia abajo para hacerlas células individuales.
Centrifugar la suspensión celular a 110 g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 1 ml de medio de células madre neurales. Estas células están listas para el cultivo o cultivo en el siguiente paso en laminado y superficie completamente recubierta para experimentos avanzados.
Al cultivar un millón de células madre neuronales primarias después de siete días, el número de células aumentará a tres a cuatro millones. Después de seis a siete días las esferas deben medir entre 150 a 200 micrómetros de diámetro y estarán listas para el subcultivo en platos laminados recubiertos de poli ornitina en ausencia de bFGF y EGF para la diferenciación neuronal. Los resultados del ensayo de citometría de flujo muestran que cerca del 95% de las células que constituyen las neuroesferas eran Nestin positivas, que es un marcador conocido para las células madre neurales.
Los ensayos que utilizan anticuerpos de proteínas fibrosas beta tubulina III y ganglio revelan que al cultivar células madre neurales en superficie recubierta alrededor del 94% mostraron fenotipo neuronal mostrado y alrededor del 5% muestran fenotipo glial. En este breve video una técnica de laboratorio para el aislamiento rápido de células madre neurales de 13 ratón embrionar eminencia gangliónica. Espero que tengas éxito en tu cultivo de células madre neurales.
