El objetivo general de este procedimiento es demostrar el desarrollo de neuroesferas a partir de neuronas mixtas primarias de hipocampo y cortical aisladas del embrión de rata E14-E16 Sprague Dawley, con el fin de ofrecer una plataforma robusta y de bajo costo para estudiar el efecto de varios conductores neuroterapéuticos. Como usted sabe, ese cerebro es una red compleja de neuronas asociadas con un gran número de células de apoyo. Para entender la función cerebral, a menudo la mayor parte de la investigación se reinicia a partir de experimentos in vitro, que involucra líneas celulares derivadas del linaje neural disponibles comercialmente.
Sin embargo, estas líneas celulares son líneas celulares transformadas que sufren de variaciones genotípicas y fenotípicas. Para abordar estos problemas, el cultivo de neuronas primarias es el enfoque adecuado. Aquí, ilustramos un protocolo simple y rentable para cultivar neuronas primarias y construimos una plataforma de detección robusta para varias terapias neuronales.
La principal ventaja de este protocolo es que con sólo modular las densidades de revestimiento celular, podemos mostrar dos plataformas de cultivo de neuronas en contraste donde la baja densidad conduce a un cultivo prolongado de neuronas primarias, y la alta densidad genera neuroesferas espontáneas. Tome dos placas de 24 pozos. Uno para alta densidad y otro para chapado de baja densidad.
Transfiera 12 mm de cubreobjetos de vidrio estéril en las placas de 24 pozos. Vierta 300 microlitros de solución PDL en cada uno de los pozos de una manera que cubra completamente la superficie de toda la cubierta. Preparar la solución de PDL a una concentración de 0,1 mg/ml en agua desionizada.
Envuelva las placas con láminas de aluminio para evitar el secado, y manténgalas en la incubadora de CO2 durante la noche. Al día siguiente, antes de enchapar, aspirar la solución PDL. Lavar correctamente con agua estéril durante dos o tres veces.
A continuación, agregue el soporte de chapado y vuelva a colocar las placas en la incubadora hasta que estén enchapadas. Sacrifica una rata Sprague-Dawley embarazada E14-E16, haz un corte en forma de V en la zona abdominal usando fórceps estériles y un par de tijeras de extremo romo. Retire todos los fetos y colóquelos cuidadosamente en la placa de petri con solución fría de HBSS.
Saque los embriones de los sacos embrionarios y lávelos cuidadosamente en un plato de petri separado en HBSS fresco y frío. Decapitar la cabeza con la ayuda de tijeras estériles. Transfiera los cabezales en las placas de petri estériles de 90 mm con HBSS frío.
Bajo el microscopio estéreo, sostenga la cabeza de la región del hocico con los fórceps serrados estériles, y saque el cerebro cortando la piel y el cráneo abierto. Retire todas las meninges de los hemisferios y del cerebro medio sosteniendo el tronco encefálica. Retire cuidadosamente los hemisferios intactos, que se asemejan a las tapas de setas que contiene el hipocampo y la corteza.
Recoger los hemisferios que contienen corteza e hipocampo intacto en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de medios de disociación. Permita que los tejidos recogidos se asienten y aspire el medio de disociación, dejando entre el cinco y el diez por ciento del medio en él. Una vez más, agregue 10 ml de medio de disociación fresca a él, y repita este paso dos veces.
Añadir 4,5 ml de medio de disociación y 0,5 ml de solución de trippsina-EDTA. Guárdalo en la incubadora a 37 grados centígrados durante 20 minutos para que la digestión continúe. Aspirar el medio y lavar con 10 ml de medio de disociación y medio de chapado, consecutivamente.
Resuspenderlos en 2,5 ml de medio de chapado. Conservar un plato estéril de 90 mm sobre la cubierta invertida del plato y verterlo en la base de un plato estéril de 90 mm. Valorar los tejidos digeridos en la base de la esquina del plato, utilizando la punta de pipeta de 1000 microlitros, con el fin de ocupar el menor volumen.
Pasar la suspensión celular obtenida a través del colador celular de 70 micrómetros, excluyendo cualquier trozo de tejido. Determine la densidad de las células viables mediante la exclusión de tinte azul de tripano y cuente el número de celdas en un contador de celdas automatizado. Diluir el número de células obtenidas de manera que la placa 1,5 en 10 a la potencia de 5 células por ml para el revestimiento de alta densidad, y 20.000 células por ml para el revestimiento de baja densidad en dos tubos separados que contienen 30 ml de medio de chapado.
Aspirar el medio de chapado previamente añadido y la placa 500 microlitros de células dispersas en medio de chapado en cada pozo. Después de eso, devuelva las placas a la incubadora durante cuatro horas. Cuatro horas después del enchapado, examine las células en busca de adherencia bajo el microscopio.
Después de cuatro horas de chapado, tanto en placas de alta como de baja densidad, las neuronas muestran una buena adherencia a las placas. Sustituya el medio de cada pozo por 500 microlitros de medio de mantenimiento fresco, e incubarlo en una incubadora a 37 grados centígrados. Tenemos que cultivar estas neuronas chapadas a alta y baja densidad.
Mientras que las neuronas chapadas de baja densidad se pueden utilizar para cultivos prolongados, hasta 30 días, cambiando el medio de mantenimiento dos veces por semana, las neuronas chapadas de alta densidad comienzan a generar espontáneamente neuroesferas, que vinieron día después de que mantuvimos en placa de fijación ultrabaja. Después de 24 horas de chapado, se observa que las neuronas chapadas de alta y baja densidad muestran una morfología saludable. Aquí se muestra una imagen de contraste de fase de las neuronas chapadas de baja densidad, cultivadas durante unos siete días.
Las neuronas muestran morfología saludable, y se pueden mantener hasta 30 días con enrutamiento e interconexiones más vigorosas. El diagrama de barras aquí muestra alrededor del 90 por ciento de viabilidad de las neuronas chapadas de baja densidad incluso después de 30 días de cultivo, según lo determinado por el ensayo MTT. Las neuronas primarias aquí se han caracterizado por la inmunomancha con Tuj 1, un marcador de neuronas diferenciadas, y tau, un marcador de axones neuronales.
La pureza de las neuronas se confirma por la ausencia de manchas en marcadores no neuronales GFAP para astrocitos y O4 para oligodendrocitos. En todos los estudios de caracterización, los núcleos se han teñido con Hoechst 33258. Aquí, las células de semillas de baja densidad se han teñido con marcador astrocítico GFAP y marcador neuronal Tuj 1 para comprobar la pureza del cultivo hasta siete días.
Se observa que este protocolo apoya el crecimiento preferencial de las neuronas sobre los astrocitos como se indica a través del análisis cuantitativo. Los núcleos han sido manchados con Hoechst 33258. Del mismo modo, en las células sembradas de alta densidad, los astrocitos han sido manchados con GFAP y neuronas por Tuj 1.
Aquí, en el análisis cuantitativo, alrededor del 17 por ciento de los astrocitos se observan en comparación con el 83 por ciento de las neuronas. Los núcleos han sido manchados con Hoechst 33258. Después de siete días, se observan espontáneamente múltiples neuroesferas en las neuronas de alta densidad.
Alrededor del octavo al décimo día de cultivo, en las neuronas chapadas de alta densidad, las neuroesferas comienzan a formar grandes proyecciones y puentes que consisten en extensiones radiales de tipo glial. Las flechas negras indican el puente entre dos neuroesferas recién formadas. Se han realizado ensayos de células vivas y muertas en las neuroesferas durante 15 días.
En la densa tinción de Calcein AM, sin absolutamente ninguna tinción de yoduro propidium, indica casi 100 por ciento de viabilidad de las neuroesferas en el cultivo. El gráfico de líneas aquí indica una expansión en el tamaño de las neuroesferas con el paso del número de días. Esta imagen demasiado manchada de la neuroesfera indica una rica población de células progenitoras neuronales a través de una mayor expresión de los marcadores NPC Nestin y Tuj 1.
Las neuroesferas aquí muestran altas cantidades de astrocitos marcados por la fuerte expresión de GFAP, acompañados de una expresión aún mayor del marcador neuronal Tuj 1. Los núcleos han sido manchados con Hoechst 33258. Así que creo que nuestro protocolo es bastante emocionante e interesante, teniendo en cuenta el hecho de que desde una sola estrategia somos capaces de obtener dos plataformas: una 2-D y una 3-D.
Y esta será una gran plataforma para la detección de diferentes pistas neuroterapéuticas. Así que supongo que es realmente útil para todos los neurocientíficos. También otro aspecto importante es que las neuroesferas en las que optamos son extremadamente ricas en células progenitoras neuronales, los PNJ.
Y se pueden utilizar para diferenciarlos en neuronas y linajes no neuronales. Por lo tanto, siento que si, realmente, la gente puede dominar esta técnica tomando ayuda de este video, será realmente muy útil para todos. Gracias.
