Este protocolo describe un método fácil y rentable para purificar las células madre del cerebelo postnatal. Estas células madre representan las interneuronas molecularmente incomprensibles que han nacido en el difunto, pero también representan astrocitos cerebelosos derivados postnatalmente. Por lo tanto, el estudio de estas células es claramente importante para entender el desarrollo del cerebelo.
Usando este protocolo, el rendimiento de las células madre es comparable al de la estrategia basada en FACS que es típicamente 10 veces más caro. Este protocolo se puede generalizar para extraer prominin-1 expresando células madre de otros tejidos como el intestino y la médula ósea. Comience colocando el plato con el cerebro bajo un microscopio de disección.
Utilice fórceps número cinco finos para extraer las meninges y los vasos sanguíneos grandes del cerebelo, luego separe el cerebelo del tronco encefálica usando la espátula. Transfiera el cerebelo a un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de solución HBSS helada. Enjuáguelo y decantar el HBSS.
Repita el lavado dos veces más. Después del último enjuague, agregue cinco mililitros de solución de disociación de tejido a base de papaína que se haya precalentado a 37 grados centígrados. Incubar el tejido durante 15 minutos en un baño de agua de 37 grados Celsius y mezclar lentamente el contenido del tubo invirándolo de tres a cinco veces cada tres minutos.
Preparar una pipeta Pasteur de vidrio de diámetro ancho y estrecho puliendo el fuego sobre un quemador Bunsen. Después de la incubación, lave el tejido tres veces con cinco mililitros de solución HBSS asegurándose de evitar la pérdida de tejido durante la decantación. Después del último lavado HBSS, agregue cinco mililitros de DPBS con 250 microlitros de DNAse al tejido y disociarlo triturando suavemente de 10 a 15 veces con la pipeta Pasteur de amplio diámetro.
A continuación, utilice la pipeta pasteur estrecha para triturar aún más la suspensión de tejido 10 veces. Si quedan trozos más grandes de tejido, presiónelos contra la parte inferior del tubo con la punta de la pipeta y continúe pipeteando hasta que se logre una suspensión fina. Coloque los tubos centrífugos sobre hielo.
Luego tensa las células disociadas a través de un colador celular de 40 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Cubra el filtro con 10 mililitros de solución HBSS helada para asegurarse de que las células pasen a través de la malla. Transfiera las células filtradas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrifuga la suspensión a 300 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, utilice un aspirador de vacío para quitar completamente el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 160 microlitros de búfer de columna magnética helada. Añadir 40 microlitros de microperlas anti-prominin-1 a la suspensión celular.
Luego incubar los tubos en un refrigerador durante 15 minutos para permitir que el anticuerpo se una a las células que expresan prominin-1. Lavar las células con uno o dos mililitros de tampón de columna X y centrifugarlas a 300 veces g durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un mililitro de tampón de columna X.Coloque las columnas magnéticas en el soporte magnético y enjuáguelas una vez con 500 microlitros de tampón X.Aplicar la suspensión de celda etiquetada en la columna y recoger el flujo en tubos frescos de 15 mililitros.
Lavar la columna tres veces con 500 microlitros de tampón X.Then retire las columnas del campo magnético y colóquelas en tubos de 1,5 mililitros. Agregue un mililitro de medio de cultivo y empuje el émbolo en la columna para eliminar las celdas etiquetadas con perlas prominin-1. Para pasar las neuroesferas, transfiéralos junto con el medio de cultivo a un tubo estéril de centrífuga de 15 mililitros.
Pelecila las neuroesferas por centrifugación a 300 veces g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en cinco mililitros de medios de disociación con papaína o 0.05%solución de trippsina e incubar las células a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Centrifugar la suspensión celular de nuevo.
Luego resuspender las células en cinco mililitros de medio neuroesfera y disociarlas pipeteándolas lentamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta Pasteur. Placar las células en medios de neuroesfera como se describe en el protocolo de texto y enriquecerlas con neuroesferas secundarias después de siete a 10 días en el cultivo como se describió anteriormente. Cuente las células en un hemocitociómetro y cubra el número óptimo de células en placas recubiertas de poli-D-lisina para futuros experimentos.
Columna purificada prominin-1 positivas células madre cerebelosas postnatales formadas neuroesferas en el medio de neuroesfera rico en factor de crecimiento. Estas neuroesferas fueron positivas para la prominin-1, su marcador utilizado para el aislamiento y para otros marcadores de células madre como nestin y GFAP. Células en el flujo a través teñido negativo para los marcadores de células madre prominin-1 y nestin y positivo para el marcador neuronal beta-III tubulina.
Tras la retirada de los factores de crecimiento y en presencia de factor inhibidor de la leucemia o PDGF-AA, las neuroesferas positivas prominin-1 se diferenciaron en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Al intentar esta técnica, es importante asegurarse de que las neuroesferas son empujadas a través de anticuerpos prominin-1 y pueden ser pasos porque las células normales también tienden a formar grumos que pueden parecer neuroesferas. Usando este método de aislamiento, uno puede caracterizar sus linajes derivados como las neuronas y la glia en la salud y la condición de la enfermedad.
Este método es valioso y proporciona una visión novedosa del papel de las células madre cerebelosas en el desarrollo cerebeloso y las condiciones de la enfermedad como la ataxia espinocerebelosa y el cáncer.
