Este protocolo permite la modulación simultánea de muchos micro ARN en células eucariotas y se basa en un método muy simple y flexible que minimiza los pasos de clonación molecular. Esta técnica tiene implicaciones para el estudio de las interacciones funcionales del micro ARN in vitro, pero lo más importante es que proporciona una plataforma para un uso más eficaz de los micro RNA en la terapia. Lo hemos desarrollado y utilizado principalmente en el contexto del cáncer cerebral, pero se aplica a cualquier enfermedad en la que intervienen múltiples alteraciones de la expresión génica.
Hemos probado nuestros genes trans artificiales en otros modelos como las líneas de cáncer de mama y tiroides que muestran la reproducibilidad de esta técnica. El conocimiento básico de la bioinformática y la biología del micro ARN es útil para este protocolo, pero no es indispensable. Un enfoque bioinformático es importante para definir las combinaciones de micro ARN relevantes y el TRK-11, mientras que la familiaridad con el procesamiento del micro ARN es importante para entender cómo estos diferentes micro ARN se pueden ensamblar en grupos de ADN artificial que se pueden procesar con éxito una vez estables a las células específicas.
Para cubrir el plato, primero disolver la poli-D-lisina en agua a una concentración de 100 microgramos por mililitro. Vierta la solución en el plato a la cantidad de un mililitro de solución por cada 25 centímetros cuadrados de superficie. Gire el plato para asegurarse de la cobertura de todo el plato.
Después de seis horas aspirar la solución de poli-D-lisina y enjuagar dos veces con PBS. Placa de células madre neurales humanas en la cantidad de 100.000 células por cada cinco mililitros del medio, ya sea en medio de células madre, medio de diferenciación astrocítica o medio de diferenciación neuronal. Después del enchapado celular, coloque el plato en una incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante una semana y proceda a realizar análisis de expresión de ARN micro de acuerdo con el manuscrito.
Para cultivar células similares al tallo del glioblastoma GBM-34, comience con una por diez a las quintas células y cinco mililitros de medio neurobasal en un matraz de unión baja de 25 centímetros cuadrados. Coloque el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. 48 horas después del enchapado, añadir concentraciones dobles de ADN alquilante agente temozolomida cada siete días.
Comience con la adición de cinco MICROmolar TMZ complementados en cinco mililitros medio durante cinco días. Después de cinco días, retire el medio y sustitúyalo por medio fresco sin temozolomida para permitir que las células sobrevivientes se recuperen. Después de 48 horas, añadir 10 temozolomida micromolar e incubar durante otros cinco días.
Repita el tratamiento con temozolomida doble hasta que se alcance la concentración de al menos 100 micromolares y las células se vuelvan resistentes al fármaco. Después de la inducción de la resistencia, células de mentira utilizando 1 mililitro de reactivo de lisis. Extraiga el ARN total y analice la expresión de los microNAs específicos según el manuscrito.
Para obtener el targetome previsto de cada micro ARN previamente definido, utilice herramientas de predicción de micro ARN. En la primera página de TargetScan, seleccione el micro ARN de interés en el menú desplegable rellenado previamente. Haga clic en el botón Enviar.
Descargue la lista resultante de destinos como una hoja de cálculo mediante el enlace de la tabla de descarga. Para reducir las posibilidades de predicciones falsas positivas, incluya solo los destinos dentro de la columna de sitios conservados y el análisis posterior. Los programas adicionales de predicción de micro ARN obtienen mayor rigurosidad y solo incluyen destinos que son comunes a todos los algoritmos.
A continuación, abra La suite ToppGene 20. Para evaluar el enriquecimiento de las vías que son comunes a cada micro ARN, pegue la lista de objetivos obtenidos en la ventana de conjuntos de genes de entrenamiento. Haga clic en Símbolo HGNC como tipo de entrada.
Haga clic en Enviar e iniciar. El programa proporciona una tabla de salida que muestra las categorías GO más significativas para la lista introducida de genes. Para establecer finalmente la contribución de cada micro ARN a la regulación de una vía común o proceso celular, abra la función venn-diagram proporcionada en el sitio web de Bioinformática y Genómica Evolutiva.
Compruebe cada targetome obtenido con la lista completa de genes involucrados en el proceso celular específico. Si los ARN de mensajería de destino para cada micro ARN de interés se encuentran en las ventanas respectivas, cargue la lista de copiar y pegar. Asigne un nombre a cada lista con un identificador único.
Haga clic en Enviar. El programa proporciona una salida visual de un diagrama de venn con números de genes en cada sector, así como una lista completa de ARN de mensajería para cada subconjunto y combinaciones de intersección. Para agrupar los micro ARN seleccionados en un gen trans funcional, obtenga un andamio transgénico basado en el locus de racimo miR-17-92.
Obtenga la secuencia de nucleótidos del navegador del genoma en conjunto. Seleccione la secuencia de núcleo de aproximadamente 800 pares base que abarca las seis horquillas de micro ARN codificadas del locus y al menos 200 secuencias de flanqueo de nucleótidos tanto aguas arriba como aguas abajo de la secuencia de núcleo. Pegue la secuencia en cualquier programa de edición de palabras.
Define la secuencia de cada uno de los seis pasadores de pelo nativos recuperandolos en la base miR. Marque cada una de estas secuencias dentro del intervalo de secuencia de núcleo previamente identificada. Cualquier secuencia entre cada horquilla representa secuencias espaciadores.
A continuación, obtener las secuencias de horquillas de micro ARN destinados a ser sobreesclarados en el gen trans de la base miR. Tenga en cuenta cuidadosamente los nucleótidos específicos que se encuentran en los sitios de escisión del microprocesador. Elimine las secuencias de horquillas nativas de la secuencia de núcleo con la excepción de tres a cinco nucleótidos en las puntas cinco y las de cada horquilla que servirán como un aceptador para las nuevas horquillas.
Pegue las secuencias de horquillas de los micro ARN deseados para reemplazar las horquillas previamente eliminadas. Añada las secuencias de restricción deseadas en ambas regiones flanqueantes del gen trans para facilitar la sub-clonación en los vectores de entrega de su elección. Verifique que las secuencias de restricción elegidas no estén presentes dentro de la secuencia misma.
Para verificar la estructura bidimensional del gen trans, copie la secuencia transgénica completa en el programa de software de predicción de estructura de ARN RNA WEBfold. Seleccione la configuración estándar del programa y haga clic en continuar. Analizar la salida gráfica, particularmente para la presencia de horquillas bien definidas en presencia de estructuras de vástago de doble hebra que son al menos 11 nucleótidos proximales al sitio de escisión del microprocesador.
Además, busque la ausencia de puntos de bifurcación dentro de las secuencias de horquillas. En este punto, el gen trans está listo para ser producido por la síntesis genética y clonado en los vectores de entrega deseados. Este método permitió la caracterización de un módulo de tres micro ARN que están constantemente regulados en tumores cerebrales, que se expresan específicamente durante la diferenciación neuronal.
Se confirmaron los patrones de coexpresión de los módulos de micro ARN durante el estrés genotóxico y se sugirió una fuerte actividad sinérgica entre estos tres microR. El gen trans diseñado podría recapitular simultáneamente la expresión de los tres microR en las células del glioblastoma, tanto in vitro como in vivo, con interferencia significativa en la biología tumoral y una aplicabilidad traslacional prometedora. Además, el cúmulo transgénico también era funcional en un modelo de cáncer de mama.
Los requisitos cruciales de este protocolo son mantener el tamaño original de la escisión del procesador en el gen trans. Y asegúrese de que se conserva la estructura del lazo del tallo de las horquillas de micro ARN quimérico. Con este método, podemos concentrar múltiples genes de micro ARN biológicamente activos en secuencias de ADN muy cortas que literalmente se pueden instalar in vitro en cualquier vector de administración para uso de terapia génica.
Este método es ideal para estudiar la interacción funcional entre diferentes micro RNAs e interferir con complejas vías celulares multifactoriales que de otro modo requerirán múltiples combinaciones de fármacos.
