El protocolo describe un enfoque simplificado para la detección y el aislamiento de microbios resistentes a metales pesados de manantiales geotérmicos. Este enfoque representa un área de investigación de creciente interés en todo el mundo para su aplicación en el campo de la biodetección y la biorremediación. El método descrito en el mismo se puede modificar fácilmente para aislar microbios de diversas fuentes ambientales como agua, alimentos, suelo o sedimentos.
La concentración inhibitoria mínima para identificar microbios resistentes es una estrategia rápida para caracterizar las nuevas especies o cepas. Este protocolo es fácil de realizar y solo requiere habilidad manual y experiencia con las técnicas básicas de microbiología. Para comenzar, inocule dos gramos de muestra recolectada en 50 microlitos de medio Luria-Bertani recién preparado con un pH de cuatro o siete.
Incubar esta muestra a la temperatura del sitio de muestreo más o menos cinco grados centígrados. Placa 200 microlitros de la muestra sobre agar Luria-Bertani con un pH de cuatro o siete y manténgalo en una condición estática a 55 o 60 grados centígrados durante 48 horas. Después de la incubación, aísle las colonias individuales y repita este ciclo de recubrimiento de rayas al menos tres veces.
Para preparar un mililitro de material de células congeladas, agregue 20% de glicerol a las células cultivadas durante la noche. Use una mezcla de acetona y hielo seco para una congelación rápida. Para preparar un inóculo a partir de una cepa de glicerol, inocule 50 microlitros en 50 mililitros de Luria-Bertani.
Para obtener un perfil de crecimiento, diluir este pre cultivo en 10 microlitros de Luria-Bertani. Para ajustar la densidad óptica a 0.1 agregue 600 nanómetros. Cultive estas células durante 16 horas a 55 o 60 grados Celsius en el agitador orbital.
Mida la densidad óptica a 600 nanómetros a intervalos de 30 minutos. Curva a partir de estos datos con tiempo en el eje X y densidad óptica a 600 nanómetros en el eje Y. Trazar curvas de crecimiento similares con pH variable del medio de cultivo, para determinar el pH óptimo para condiciones de laboratorio, inocular el aislado rayado de la cepa de glicerol en 50 microlitros de medio Luria-Bertani e incubar durante la noche.
Centrifugar este cultivo cultivado durante la noche durante 10 minutos a 5, 000 veces G, luego desechar el sobrenadante y cosechar la paleta de cultivo. Preparar 10 mililitros de tampón de lisis de bacterias compuesto por 20 milimolares Tris-HCL, dos milimolares EDTA, 1.2% Triton X-100 y 20 miligramos por mililitro lisosoma inmediatamente antes de su uso. Vuelva a suspender el pellet en 180 microlitros de tampón de etólisis.
Extracción de ADN genómico según las instrucciones en el kit de purificación y medición de ADN genómico y su pureza por UV-Vis. Para evaluar la pureza, determine las relaciones de densidad óptica de 260 a 280 y de 260 a 230. Evaluar la integridad del ADN genómico cargando 200 nanogramos de cada muestra en un gel de agarosa al 0,8% y comparando la distribución del tamaño con un marcador molecular de altura y peso.
Cultive el aislado a partir de cepas de glicerol en 200 mililitros de Luria-Bertani condiciones óptimas de pH y temperatura. Diluir cada pre cultivo en cinco mililitros de medio Luria-Bertani en 50 mililitros de tubos de polipropileno que contengan concentraciones crecientes de metales pesados y antibióticos para obtener una densidad óptica de 0,1 a 600 nanómetros. Cultive las células durante 16 horas en un agitador orbital con 180 revoluciones por minuto a 55 o 60 grados centígrados.
Calcule la concentración inhibitoria mínima para antibióticos o metales pesados identificando los valores de concentración en los tubos donde no se produce crecimiento microbiano. Comprobar que la concentración es inhibitoria y no letal para las células mediante el emplatado de 200 microlitros del cultivo cultivado a concentraciones inhibitorias mínimas sobre placas de agar Luria-Bertani y verificando la presencia de colonias tras la incubación nocturna. Este protocolo se utilizó para analizar muestras bacterianas del área de Piscarelli, un ambiente geotérmico sulfúrico ácido La caracterización fenotípica de los microorganismos aislados mostró que el aislado uno tiene una mayor tolerancia al arseniato y al vanadato y es resistente al cadmio.
Los datos comparativos sugieren que aislar uno tiene una fuerte resistencia al arsénico pentavalente, mientras que aislar dos tiene resistencia al arsénico trivalente. Las pruebas de resistencia a los antibióticos mostraron que aislar uno es altamente sensible a todos los antibióticos probados, incluso cuando se usaron concentraciones bajas. Por el contrario, el aislado dos es resistente a todos los antibióticos probados, excepto al cloranfenicol y la tetraciclina.
El microorganismo probablemente ha adquirido resistencia a los antibióticos debido a mutaciones aleatorias o transferencia horizontal de genes que representan una ventaja selectiva en condiciones ambientales extremas. Este estudio demuestra la utilidad de tales métodos para seleccionar microorganismos ambientales que puedan inactivar los contaminantes y convertirlos en productos inofensivos.
