The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

La Figura 3 muestra un resumen del procedimiento experimental. 1. Preparación del tejido <ol><li> Para determinar las consecuencias de la expresión modificada de un gen de interés, establecer la siguiente cruz por duplicado y se mantiene a 25 ° C: UAS transgenes (machos) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6B (hembras vírgenes) NOTA: Para obtener el control cruzado tejido UAS-lacZ varones de GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: hembras GFP. β-galactosidasa no genera defectos en el comportamiento celular en la retina. </li><li> Para mejorar la eficacia de los transgenes RNAi, cruz UAS-RNAi varones de GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6B hembras vírgenes. NOTA: defectos ocasionales en el comportamiento de células que expresan en retinae se han observado ectópico DCR-2 (datos no mostrados). La vigilancia se recomienda si el uso de este enfoque. </li><li> Selecto blanco pre-pupas de genotipos adecuados y colocar en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Si el pupas expresar DCR-2, seleccione pupas ya sea hombre o mujer: expresión de UAS-DCR-2, una inserción en el cromosoma X, es más fuerte en los hombres. Las pupas se debe sexuado a 0 h APF antes de la pigmentación de la envoltura pupal - las gónadas de los machos se ven como grandes globos translúcidos en los lados laterales de la pupa (aproximadamente un tercio de la parte posterior). </li><li> Incubar los tubos de microcentrífuga que contienen pupas, en un plástico punta-caja limpia a 25 ° C. Para evitar la desecación de lugar pupas a 10 cm 2 de tejido, empapado en agua destilada, a la caja de punta. NOTA: si la humedad en la caja de la punta es demasiado alta el caso de pupa puede llegar a ser empapado y difícil de diseccionar en los pasos posteriores. </li><li> Incubar durante el tiempo adecuado. Para capturar comportamientos celulares asociadas con modelar el ojo, preparar pupas para imágenes en torno a 17 horas APF, APF 20 horas o 24 horas APF. Ver representativos Resultados para mayor discusión sobre si se respetan mejor los comportamientos específicos de células. </li><li> Coloque un pedazo de cinta adhesiva de doble cara fresca en un plato de disección Sylgard negro. Coloque un lado pupa, dorsal hacia arriba, con la cabeza de la pupa adherido a la cinta de doble cara (Figura 1A) .Try no se adhieren las regiones torácica y abdominal de la pupa a la cinta de doble cara. Con pinzas levante con cuidado y quitar el opérculo para exponer la cabeza de pupa. Tear a lo largo del lado de la caja de pupa para exponer el área alrededor de un ojo. </li><li> Retire con cuidado la pupa de la cinta adhesiva. Si la pupa permanece adherente, aplicar un pequeño volumen de agua destilada a la unión entre el caso pupal y la cinta para debilitar la adhesión. </li></ol> 2. Montaje <ol><li> Construir una pequeña 15 mm 2 marco de papel secante y perforar un agujero en la middlethat es de 5,5 mm de diámetro (Figura 1B). Sumergir en agua destilada y colocar enel centro de un portaobjetos de microscopio. Con una jeringa de 30 cc, exprima un anillo uniforme de vaselina para rodear el marco de papel secante. Asegúrese de que el anillo de vaselina es ligeramente mayor que la anchura de la pupa y que el diámetro del anillo es ligeramente menor que la anchura de una hoja de cubierta. </li><li> Añadir una pequeña gota de vaselina directamente sobre la diapositiva, en el agujero perforado en el papel secante (Figura 1C) .Carefully organizar la pupa, por su parte, con el apoyo de la perla de vaselina (Figura 1D). </li><li> Coloque un cubreobjetos en la parte superior del anillo de la jalea de petróleo de manera que entra en contacto con el epitelio encima de la neuroepitelio ojo (Figura 1D). Comprimir ligeramente la preparación para sellar el cubreobjetos contra la vaselina y generar una pequeña superficie de contacto plana entre la región de los ojos de pupa y el cubreobjetos. </li></ol> 3. La fluorescencia de imágenes <ol><li> Image la preparación de pupa utilizando unamicroscopio de fluorescencia. Cada 7 min captura de secciones en serie a través del dominio apical del neuroepitelio ojo, en la región de las uniones adherentes. NOTA: a) las secciones de serie apropiados son generalmente 4-5 por z-pila compuesta de 0,2 micras z pasos. b) Irregularidades en la topología del epitelio, incluyendo golpes suaves y pliegues, puede hacer que sea difícil para adquirir imágenes en foco de grandes regiones del tejido. Si bien las imágenes, se puede encontrar parte de un área de interés para estar en foco, y una región vecina a estar fuera de foco. La inclusión de una pequeña gota de agua destilada entre el ojo y el cubreobjetos pupal puede eliminar algunos pliegues de tejido aguda, pero no la característica topología ligeramente desigual de las primeras etapas de la morfogénesis del ojo de pupa. En estos casos sobremuestrear el tejido mediante la ampliación de la z-pila hasta de enfoque rebanadas se adquieren por todo el campo. c) La captura de secciones seriadas cada 7 min debe permitir en vivo de imágenes de 3 a 4 horas sin un importante reducción en la intensidad de fluorescencia de GFP que puede comprometer la calidad de la imagen. Intervalos de tiempo más cortos pueden reducir el tiempo total de formación de imágenes. </li><li> Continuar imágenes para 3 a 4 horas. No utilice un enfoque automático y función de tiempo que está disponible en muchos microscopios fluorescentes ya que el crecimiento de pupa y el bombeo de la hemolinfa mueve la posición de la retina y vigilante reorientar se requiere cada 14-21 min. NOTA que la imagen más allá de 4 horas puede retardar o detener la morfogénesis del ojo. </li><li> Utilice software de deconvolución adecuada para reducir el fondo y mejorar el contraste de las imágenes en la sección de serie. Para cada archivo z-stack, realice lo siguiente en software LAS AF (véase la Tabla de Materiales): Navegue hasta el panel Herramientas, seleccione 3D Deconvolución y haga clic en Aplicar. </li><li> Generar una imagen de proyección máxima (MP) para cada archivo de pila deconvoluted: Navegue hasta el panel Herramientas, seleccione la proyección en 3D y haga clic en Aplicar. NOTA: El algoritmo de máxima proyección puede no generar un uniformely imagen enfocada para el tejido que ha sido muestreada. Una técnica para el afilado de las regiones fuera de enfoque se describe en el paso 5.2. </li></ol> 4. Post-proyección de imagen Pupal Rescate y fenotipo Verificación <ol><li> Para determinar si los artefactos fueron introducidos o la pupa dañado durante la exploración, retire con cuidado la pupa de la plataforma de formación de imágenes: el uso de fórceps quitar el cubreobjetos y transfieren la pupa a un vial limpio de comida. Guarde a temperatura ambiente o 25 ° C hasta que emerge la mosca adulta. </li><li> Examine cuidadosamente el fenotipo del ojo adulto y comparar a los ojos de las moscas adultas emergen de la cruz mosca originales. </li></ol> Procesamiento 5. Imagen <ol><li> Alineación automática de imagen: NOTA: El tejido Drosophila vivo cambiará y crecer a lo largo del proceso de formación de imágenes. En consecuencia, los centros de imágenes recogidas en puntos de tiempo sucesivos pueden no corresponder al mismo punto en el tejido Drosophila. Además, eltodo el disco retina gira alrededor de 30 ° entre ~ 21 y 23 horas APF. Para resaltar los comportamientos individuales de células y reducir las distracciones causadas por el crecimiento del organismo, alinear cada MP image.While esto se puede realizar de forma manual, el software de edición de imagen utilizada aquí (véase la Tabla de Materiales) ha algoritmos incorporados que pueden acelerar el proceso. <ol><li> En la ficha Archivo del menú principal, Scripts abiertos y seleccione Archivos de carga en la pila. </li><li> Importe los archivos de imagen de MP en el panel de capas de la carga y seleccione Aceptar. Asegúrese de que no está seleccionada la opción Intentar Images Fuente para alinear automáticamente. NOTA: Si se selecciona esta opción, el software puede utilizar un algoritmo de alineamiento que distorsiona los datos de la imagen. </li><li> Una vez que todos los archivos MP han cargado en el panel Capas, asegúrese de que todas las imágenes están en orden cronológico tal que el menor período de tiempo es en la parte superior de la pila de capas. Si las capas no están en el orden correcto, arrastrar y soltar hasta que se ordenancorrectamente. </li><li> Seleccione Alinear capas automáticamente desde la pestaña Editar del menú principal. Elija Reposición y haga clic en Aceptar. </li><li> Si el algoritmo de alineación automática falla para orientar los marcos de un centro de coordinación pertinente, realizar pequeños ajustes con la herramienta Mover. </li></ol></li><li> Afilado Compuesto: NOTA: las regiones fuera del foco de una imagen inicial MP pueden ser afiladas por &#39;recorte&#39; del correspondiente pila deconvoluted en software LAS AF. Recorte de un archivo de pila permite que uno restringir manualmente el intervalo de un z-pila que se somete al algoritmo de proyección máxima. <ol><li> Busque la función Recortar en el panel Herramientas (en la pestaña de procesos). Restringir manualmente las rebanadas iniciales y finales de tal manera que abarcan sólo el cinturón de la adhesión dentro de la región inicialmente fuera de foco. Haga clic en Aplicar para generar un nuevo archivo de pila que está optimizado para esta región. </li><li> Generar una nueva proyección máxima de la pila optimizada a nivel local y de exportación como un archivo TIFF. </li><li> En ªe software de edición de imagen (véase la Tabla de Materiales), Scripts abiertos (ubicadas en la ficha Archivo del menú principal) y seleccione Cargar archivos en pila. </li><li> Importe el archivo de imagen MP inicial y archivo MP optimizado localmente para un momento determinado punto en el panel de capas de la carga y seleccione Aceptar. Asegúrese de que no está seleccionada la opción Intentar Images Fuente para alinear automáticamente. </li><li> Seleccione las dos capas en las capas panel y seleccione Fusionar capas automáticamente (ubicado en la ficha Edición del menú principal) para enmascarar automáticamente las regiones apropiadas de las dos imágenes, produciendo una manera uniforme en-foco del campo de la retina. Guarde esta imagen compuesta como un archivo TIFF. </li><li> Repita los pasos 5.2.1 a través de 5.2.5 para todas las imágenes subóptimas MP. </li></ol></li><li> Ajustes Adicionales: girar, recortar y ajustar los niveles de las capas de película: <ol><li> Con todas las capas seleccionadas, utilice la herramienta de transformación (Edición&gt; Transformación libre) para girar las imágenes de forma que el eje dorsal-ventral de la retina está alineadopara el eje y de la trama de la película. </li><li> Si es necesario, utilice la herramienta de recorte para reducir el campo de visión de un tamaño y forma deseados. </li><li> Use ajuste de nivel (de fotogramas individuales) para ayudar a mejorar el contraste entre la membrana celular y cuerpo celular. </li><li> Para efectos estilísticos y hacer hincapié en los comportamientos específicos de células, introducir falso color para resaltar los puntos de interés en cada fotograma. </li></ol></li><li> Animación: convertir las imágenes en una película: <ol><li> Abra el panel Animación desde la ficha de Windows del menú principal. Seleccione Crear cuadros de Capas en el menú situado en la esquina superior derecha del panel Animación. </li><li> Tenga en cuenta que las capas se añaden al panel de animación en orden secuencial comenzando desde la parte inferior de la pila. Para invertir el orden de los marcos, primero seleccionar todos los fotogramas y seleccione Invertir fotogramas desde el menú del panel Animación. </li><li> Seleccione un tiempo de demora de fotogramas para cada fotograma utilizando el menú desplegable debajo del pulgar marcouña. NOTA: La demora de fotogramas de películas 1 a 4 se presenta en este documento es de 0,8 seg. </li><li> En la ficha Archivo del menú principal, abierta Exportación y seleccione Render video. Elige QuickTime exportación bajo Opciones de archivo y seleccione un formato de vídeo deseado. Bajo Render opciones SET Frame Rate en Personalizado, introduzca una velocidad de 15, y haga clic en Render. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

La descripción del desarrollo de tipo salvaje (arriba) forma la base para las comparaciones de eventos patrones en RNAi o genotipos sobreexpresión. Las comparaciones de desarrollo de tejido vivo son muy valiosos para determinar con precisión qué comportamientos celulares están regulados por una proteína de interés. Además, y no se describe aquí, imágenes de células vivas permite a uno hacer descripciones cualitativas y / o cuantitativas de la función de un gen de interés en los eventos que el patrón del oj...

El compuesto Drosophila ojo se caracteriza por la disposición de sus estereotipada ~ 750 ommatidia separadas por un panal de celosía de las células de pigmento de accesorios 4,5. Estas células pigmentarias se modelan mediante una combinación coordinada de eventos: los movimientos celulares locales, el crecimiento celular, los cambios en la forma celular y la apoptosis. La visualización en directo de este epitelio permite estudiar los mecanismos moleculares que sustentan estos eventos en un contexto tridimensional fisiológicamente relevante e imperturbable. En contraste con los protocolos anteriores 6,7, la técnica descrita aquí incorpora un método eficaz para estabilizar el movimiento tejido extraño que no puede ser desacoplado del proceso de formación de imágenes. Este método mejora estudios de comportamiento de las células en el desarrollo de Drosophila epitelio ojo pupal - un tejido que crece, gira, y los cambios en el curso de formación de imágenes. Además, el movimiento de estabilización técnica dedescrito aquí será de gran utilidad para el estudio de las células en otros contextos donde se produce el movimiento extraño. Para visualizar límites de las celdas en el campo de la retina Drosophila, líneas de moscas transgénicas se generaron que expresan ubi-DE-cadherina: GFP, así como UAS-α-catenina: GFP bajo el control del controlador de ojos específica GMR-GAL4 1-3. El uso de dos marcadores de membrana GFP-etiquetados permite la visualización de límites de las celdas en la luz de menor intensidad. Esto minimiza el daño tisular y photobleaching en la exposición repetida a longitudes de onda de alta energía, lo que permite una mayor velocidad de fotogramas y la duración de la película. Para mejorar la eficacia de los transgenes RNAi, UAS-DCR-2 también se incorporaron a una segunda línea de la mosca 8. En una tercera actualización de los protocolos anteriores, un equipo de formación de imágenes más simple que se monta fácilmente en la mayoría de los laboratorios se describe. Este aparato evita la necesidad de tener una imagen especializada rig genera de una universidad &#39;tienda de máquina o un servicio similar. Este aparejo de formación de imágenes es similar a la utilizada para otros tejidos imagen pupal 9,10. Se presenta aquí es un simple protocolo de imágenes de células vivas que se puede utilizar para evaluar directamente los eventos morfogenéticos que contribuyen a modelar el ojo del ~ 17 a 42 horas después de la formación pupario (hr APF). En concreto, este protocolo permite a uno para determinar las consecuencias de la modificación de la expresión génica durante el desarrollo pupal.

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&amp;nbsp;</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch double stick tape</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Black Sylgard dissection dish</td><td></td><td></td><td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (Black)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm glass coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>Or purchase at local pharmacy.</td></tr><tr><td>30 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

Procesos inherentes al desarrollo de pupa Drosophila pueden cambiar y distorsionar el epitelio del ojo de manera que tengan el comportamiento de células individuales difíciles de rastrear durante imágenes de células vivas. Estos procesos incluyen: la rotación de la retina, el crecimiento celular y el movimiento del organismo. Además, las irregularidades en la topología del epitelio, incluyendo golpes sutiles y se pliega a menudo presentados como la pupa se prepara para la imagen, hacen que sea difícil de adquirir imágenes en foco de más de unos pocos ommatidia en un solo plano focal. El flujo de trabajo describe aquí remedios estos temas, lo que permite un fácil análisis de procesos celulares durante el desarrollo del ojo Drosophila pupa. Pupas adecuadamente organizado, están dispuestos en una plataforma de imágenes que se pueden montar fácilmente en la mayoría de los laboratorios de la ubiquitina-DE-cadherina:. GFP y GMR-GAL4 impulsada UAS-α-catenina: GFP se utilizan para visualizar los límites celulares en el epitelio del ojo 1 -3. Después de deconvolución esaplicado a las imágenes fluorescentes capturados en múltiples planos focales, las imágenes de proyección máxima se generan para cada punto de tiempo y mejorar el uso de software de edición de imágenes. Algoritmos de alineación se utilizan para estabilizar rápidamente el movimiento superfluo, haciendo que el comportamiento célula individual más fáciles de seguir.

Live-proyección de imagen del ojo de pupa es una estrategia exitosa para observar comportamientos celulares que contribuyen al patrón del neuroepitelio. El papel de las proteínas específicas se puede evaluar fácilmente mediante la expresión de transgenes que modifican los niveles de proteína durante el desarrollo del ojo. Para ello GMR-GAL4 se utiliza para conducir la expresión del transgen detrás de la morfogénesis surco. Esto ofrece la ventaja de no perturbar eventos anteriores que establecen el cam...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.4K vistas.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Video: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Investigación

Neurociencias

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Biología del Desarrollo

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biología

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imágenes en vivo extendidas de la morfogénesis de las patas de la pupa de Drosophila sin pupario

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Descubriendo estructuras epiteliales dinámicas durante el desarrollo de Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live-proyección de imagen de la

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Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario