Los organoides son una poderosa tecnología in vitro utilizada para la detección de drogas y la comprensión de los procesos biológicos. Por lo tanto, la generación de organoides que modelan la lengua es crucial para estudiar el desarrollo y la regeneración de las células gusta gustativos. Los estudios tradicionales de sabor in vivo pueden ser costosos y llevar mucho tiempo.
Este protocolo organoide ofrece una alternativa estandarizada y reproducible que minimiza esos desafíos al tiempo que permite experimentos de mayor rendimiento. Después de sacrificar a un ratón adulto, use tijeras de disección estériles grandes para cortar las mejillas y romper la mandíbula. Luego, levante la lengua y corte el frenillo lingual para separar la lengua del piso de la cavidad oral.
Cortar la lengua y recogerla en dPBS estéril helado con calcio y magnesio. Bajo un microscopio de disección, retire y deseche la lengua anterior cortando justo la parte anterior de la eminencia inter malar con una cuchilla de afeitar. Luego use una delicada toallita de tareas para eliminar el vello y el exceso de líquido de la lengua posterior.
A continuación, llene una jeringa de un mililitro con 200 a 300 microlitros de solución enzimática inyectable e inserte una aguja de media pulgada de calibre 30 justo por encima de la eminencia inter malar hasta justo antes de las papilas circunvaladas, o CVP. Inyecte la solución enzimática debajo y en los bordes laterales de la CVP entre el epitelio y los tejidos subyacentes. Retire la jeringa lenta y continuamente de la lengua mientras se inyecta la solución.
Incubar la lengua y el dPBS estéril libre de calcio y magnesio a temperatura ambiente durante exactamente 33 minutos. Usando tijeras de disección extrafinas, haga pequeños cortes en el epitelio bilateralmente y justo antes de la CVP. Luego pela suavemente el epitelio levantándolo con forrceps finos.
Una vez que el epitelio de la zanja esté libre del tejido conectivo subyacente, colóquelo en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros, precubierto con FBS. Agregue el cóctel de enzimas de disociación a los tubos que contienen los epitelios CVP pelados e incube en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 45 minutos con un breve vórtice cada 15 minutos. Durante los últimos 15 minutos de incubación, precalen un 0,25% de Tripsina-EDTA en el baño de agua.
Después de la incubación, vórtice los tubos en triturar con una pipeta Pasteur de vidrio durante un minuto. Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante que contiene la primera colección de células disociadas en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros recubiertos de FBS. Gire el sobrenadante durante cinco minutos a 370 veces G y cuatro grados Celsius para peletizar las células.
Retire el sobrenadante resultante, luego vuelva a colocar el gránulo celular en el tampón FACS y manténgalo en hielo. Para disociar las piezas de tejido restantes en los tubos de microcentrífuga originales de dos mililitros, agregue tripsina-EDTA 0.25% precalentadas e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos con un breve vórtice cada 10 minutos. Luego, tritura las piezas de tejido con una pipeta Pasteur de vidrio durante un minuto.
Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contienen las células disociadas previamente recolectadas en el tampón FACS. Girar los tubos con las células disociadas. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a colocar los gránulos celulares en el tampón FACS y manténgalos en hielo.
Luego, aísle las células positivas Lgr5-GFP a través de FACS utilizando el canal de proteína fluorescente verde como se describe en el manuscrito de texto. Transfiera el número deseado de células suspendidas positivas Lgr5 a un nuevo tubo de microcentrífuga. Gire el tubo durante cinco minutos a 370 veces G y cuatro grados Celsius para peletizar las células.
Retire el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo. Resuspenda suavemente el pellet celular en la cantidad adecuada de gel de matriz con pipeteo suave. Luego mantenga el tubo de la microcentrífuga sobre hielo en un tubo cónico de 50 mililitros para evitar que el gel de matriz se gelifique.
Agregue 15 microlitros del gel de matriz en la mezcla celular en el centro de cada pozo de una placa de 48 pozos. Para garantizar una distribución uniforme de las células, mezcle el gel de matriz y la mezcla de células mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo después de emplatar cada tres pozos. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad durante 10 minutos para permitir la gelificación del gel de matriz.
Luego, agregue 300 microlitros de medios WENRAS a temperatura ambiente complementados con el inhibidor de roca, Y27632, a cada pozo y devuelva la placa a la incubadora. Dos días después del revestimiento, retire el medio de cada pozo con una pipeta de un mililitro o mediante aspiración al vacío, asegurando que no haya contaminación cruzada entre condiciones. Agregue 300 microlitros de medios WENRAS por el costado del pozo, teniendo cuidado de no interrumpir el gel de la matriz y devolver la placa a la incubadora.
Cuando los organoides linguales se cultivan utilizando medios WENR, no crecen de manera eficiente. Sin embargo, después de agregar A 83-01, un inhibidor de la señalización TGF-beta, y SB202190, inhibidor de la señalización de la quinasa mapa P-38, se observa un crecimiento robusto. Curiosamente, la eliminación de estos inhibidores de los medios después de seis días da como resultado una mayor expresión del marcador general de células receptoras del gusto, Kcnq1, lo que sugiere que A 83-01 y SB-202190 dificultan la diferenciación de las células gusta gusta gustares.
Así, el crecimiento y la diferenciación óptimos se obtienen cultivando organoides en medios WENRAS desde el día cero hasta el seis y medios WENR desde el día seis hasta el 12. Los organoides maduros contienen células gustales marcadas por queratina-8 y células epiteliales no gustales marcadas por queratina-13. Además, la queratina-13 se expresa en niveles más altos que los tres marcadores de células receptoras del gusto, lo que sugiere que los organoides están compuestos predominantemente de células epiteliales no gustales.
Los organoides expresan todos los tipos de células receptoras del gusto. Las células de tipo uno marcadas por Entpd2 y las células amargas de tipo dos marcadas por Gnat3 están altamente expresadas en organoides de sabor, mientras que las células de tipo tres de detección agria marcadas por Car4 son menos comunes. Las células receptoras del gusto se distribuyen aleatoriamente en los organoides en lugar de en estructuras discretas de papilas gustativas observadas in vivo.
Asegúrese de incluir un poco de tejido posterior al CVP al diseccionar la lengua de la cavidad oral. Además, asegúrese de que ambas zanjas salgan y se obtengan al pelar el epitelio.
