Este protocolo permite medir la capacidad de los anticuerpos para opsonizar e inducir la fagocitosis de plasmodium falciparum infectado eritrocitos. Se pueden probar los anticuerpos presentes en el suero de individuos expuestos naturalmente a la infección por parásitos, así como los inducidos por la inmunización con antígenos parásitos. Demostrando el procedimiento conmigo estará Maiken Visti, un técnico de mi laboratorio.
Para establecer un cultivo celular THP-1 para un ensayo de fagocitosis, el día antes del experimento sembraron las células en un matraz de cultivo cuadrado de 25 centímetros y una concentración de 2,5 veces 10 a las quintas células por mililitro en THP un medio de cultivo celular. El día del experimento, al menos una hora antes del experimento se bloquea a placas de 96 pozos de fondo con 150 microlitros de 2% FBS estériles en PBS por pozo. Para la cosecha y purificación de eritrocitos infectados por trofozoítos de mediados a finales de etapa, preparar alrededor de 1,2 mililitros de cultivo de parásitos P falciparum envasado en 10 mililitros de medio de cultivo de parásitos, con al menos 5% parasitemia y añadir a una columna magnética.
Lavar la columna con 50 mililitros de medio de cultivo de parásitos. Para eluir a los eritrocitos infectados, retire la columna del imán y eléjela con 50 mililitros de medio de cultivo de parásitos. Luego, recoger los eritrocitos infectados por centrifugación y resuspend el pellet en un mililitro de medio de cultivo de parásitos frescos para el conteo.
Ajustar la suspensión de eritrocitos infectada purificada 3,3 veces 10 veces a las séptimas células por mililitro en un medio de cultivo de parásitos que contenga bromuro de etidio, a una concentración final de 2,5 microgramos por mililitro. A continuación, retire la solución de bloqueo de una placa de 96 pozos moviendo la placa en un contenedor de residuos. A continuación, retire cualquier exceso sobre una toalla de papel y agregue 30 microlitros de la etiqueta de bromuro de etidio en suspensión de eritrocitos infectada a todos los pozos excepto a uno en la mitad superior de la placa.
Añadir 30 microlitros de medio de cultivo de parásitos al pozo vacío, e incubar la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Al final de la incubación, añadir 170 microlitros de medio de cultivo de parásitos a cada pozo y sedimentar los eritrocitos infectados en la parte inferior de la placa por centrifugación. Retire el sobrenadante moviendo la placa en un recipiente de desecho, y lave los eritrocitos infectados con sello de bromuro de etidio dos veces más, con 200 microlitros de medio de cultivo de parásitos por bien, como acaba de demostrar.
Después del segundo lavado, utilice una pipeta multicanal para eliminar cuidadosamente todo el volumen de sobrenadante de cada pozo, sin alterar los pellets. Y resuspender los eritrocitos infectados con sello de bromuro de etidio en 30 microlitros de solución de anticuerpos, incluidos los controles y muestras de prueba adecuados previamente preparados en un medio de cultivo de parásitos. A continuación, coloque la placa a 37 grados centígrados durante 45 minutos, protegida de la luz.
Mientras que los eritrocitos infectados están siendo opsonizados, recoger las células THP-1 por centrifugación, y resuspender el pellet en 12 mililitros de medio de cultivo celular THP-1 fresco, precalentado. Después de una segunda centrifugación, resuspendir el pellet en un mililitro de medio de cultivo celular THP-1 para el recuento, y ajustar la concentración celular a cinco veces 10 a las quintas células por mililitro en el medio de cultivo celular THP-1. Retire la solución de bloqueo de la segunda placa de 96 pozos y agregue 100 microlitros de células THP-1 a cada pozo.
A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación de opsonización, añadir 170 microlitros de medio de cultivo de parásitos a cada pozo de la placa de opsonización, y sedimentar los eritrocitos infectados en el fondo de la placa por centrifugación. Lavar los eritrocitos infectados opsonizados dos veces con 200 microlitros de medio de cultivo de parásitos por pozo, utilizando una pipeta multicanal para quitar cuidadosamente el sobrenadante después del segundo lavado.
Resuspender los eritrocitos infectados opsonizados en 100 microlitros de medio de cultivo celular THP-1 precalentado por pozo, y transferir 50 microlitros de cada suspensión de eritrocitos infectado opsonizado a un pozo correspondiente en la placa de fagocitosis. Cuando se hayan añadido todas las células, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante no más de 40 minutos, protegida de la luz. Al final de la incubación, detener la fagocitosis por centrifugación a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante y resuspendir los pellets con 150 microlitros de solución de colorante de cloruro de amonio a temperatura ambiente por pozo. Después de exactamente tres minutos, agregue 100 microlitros de hielo frío al 2%FBS en PBS para detener la lelisis, y sedimente las células intactas por centrifugación. A continuación, lavar las células tres veces con 200 microlitros de hielo fresco 2%FBS en PBS por pozo, por lavado.
Después del lavado final, resuspender el pellet celular en 200 microlitros de hielo fresco 2%FBS en PBS por pozo. Para la adquisición y análisis de citometría de flujo, cargue inmediatamente las células en un citometro de flujo y utilice la gráfica de dispersión lineal hacia adelante frente a lado lineal para los pozos sin eritrocitos infectados para cercar las células THP-1. Adquiera 10.000 eventos en esta puerta y utilice las células THP-1 con los eritrocitos infectados opsonizados con un control positivo para configurar una gráfica de histograma para medir la intensidad de fluorescencia del bromuro de etidio.
Para el análisis, abra la gráfica de dispersión lineal hacia delante frente frente a lado lineal para los pozos sin eritrocitos infectados, y puerta las células THP-1. Luego, configure una puerta positiva en un histograma FL-3 y copie estas puertas en todos los otros pozos de muestra para determinar el porcentaje de células THP-1 de bromuro de etidio positivo. Para cada muestra analizada, la fagocitosis puede notificarse como el valor absoluto o como la fagocitosis relativa calculada como un porcentaje utilizando el control positivo como máximo.
Las células THP-1 deben ser revisadas periódicamente para la expresión de la superficie del receptor gamma FC por citometría de flujo. Las células deben ser negativas para CD16 y positivas para CD32 y CD64. En este experimento de opsonización, las células THP-1 fueron cerradas primero de acuerdo con sus perfiles de dispersión hacia adelante y lateral, para permitir la cuantificación del porcentaje de células etiquetadas con bromuro de etidio, indicativas de células que han fagocitotizado al menos un anticuerpo opsonizado eritrocitos infectados.
Las muestras de control negativo deben generar un único pico negativo en el canal FL3, con pocos eventos observados en el marcador de bromuro de etidio. En consecuencia, los valores medios de fagocitosis, tanto como células THP-1 positivas absolutas de bromuro de etidio y como porcentajes relativos de fagocitosis, deben ser muy bajos. Por el contrario, el control positivo debe generar trazas con dos picos, un pico negativo y un pico claramente positivo y bien separado situado dentro del marcador de bromuro de etidio.
Los valores medios de fagocitosis son normalmente más altos para el control positivo, seguidos por la piscina femenina expuesta al paludismo y los controles de una sola mujer expuesta al paludismo. Aunque esta metodología genera resultados consistentes, se han observado desviaciones en el coeficiente de pendiente de las líneas ajustadas. Por lo tanto, se recomienda el uso de valores relativos, especialmente si no es posible ejecutar todas las muestras en un solo experimento.
Asegúrese de planificar cuidadosamente el experimento con una pureza superior al 80%Además, asegúrese de incluir siempre los controles adecuados, para permitir que se evalúe la calidad del experimento y facilitar el análisis de datos.
