このプロトコルは、ヒト白血球による標識アスペルギルス・フミガトゥール・コニディアの貪食作用、および細胞へのコニディアの付着性、およびフローサイトメトリーによる相互作用の欠如を定量的に測定するため、重要である。この方法の主な利点は、多数の細胞の高速分析を容易にすることです。さらに、細胞マーカーの標識は、同じサンプル内の好中球および単球の評価を分離することを可能にする。
この技術では、ムコレスのような他の臨床関連菌を分析するために使用することができます。代わりに赤血球は食細胞として使用される可能性があります。.この手順を開始するには、ペーパータオルに消毒剤を入れ、バイオセーフティキャビネットに入れてください。
揮発性コニディアの過剰流通を防ぐために、ペーパータオルの上に成長したアスペルギルスフミガトゥスのプレートを置きます。真菌の上に0.01%の洗剤を含むPBSの10ミリリットルを加え、ドリガルスキースパチュラを使用してプレートの上に液体を広げ、暗い色のコニディアをこすり落とします。コニディア懸濁液を30マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルに移し、残ったミセリアを取り除きます。
洗剤付きのPBSを10ミリリットル追加し、ヘラで広げ、ストレーナーを通して同じチューブに移します。次に、0.1モル炭酸ナトリウムの無菌溶液を調製し、PBSに溶解する。この炭酸ナトリウム溶液中にFITC粉末の0.1ミリモル溶液を調製する。
このFITC溶液の5ミリリットルで、1億個以下のコニディアを15ミリリットルのチューブに再懸濁させる。摂氏37度で20分間インキュベートします。コニディアに膨らむには、10%FCSを補った5ミリリットルのRPMI培地で、適合標識されたConidiaを再中断する。
そして、所望の時間のために摂氏37度で回転器でインキュベート。バイオセーフティキャビネットでは、5ミリリットルのバフィーコートを50ミリリットルのチューブに入れる。ELバッファーでチューブを満たし、3回反転します。
混合物の乳白色の外観が明らかになるまで、5〜8分間水平にインキュベートします。その後、遠心分離機をGの300倍、室温で10分間行う。上清を捨て、ピペット処理により1ミリリットルのELバッファーにペレットを再懸濁します。
ELバッファーの別の 24 ミリリットルを追加し、チューブを数回反転します。遠心分離機はGの300倍、室温で5分間。上清を捨て、1ミリリットルのRPMI培地で細胞を再懸濁し、10%FCSを補う。
まず、10%FCSを補充したRPMIの1.5ミリリットルで200万個の白血球と400万個のFITC標識コニディアを12ウェル培養プレートに移します。コニディアのないセルのコントロールと、ラベルのない Conidia を持つセルのコントロールを含めます。所望の時間のために摂氏37度で、加湿二酸化炭素インキュベーターでプレートをインキュベートします。
インキュベーションが完了したら、細胞スクレーパーを使用して細胞を収穫し、15ミリリットルのチューブに移します。まず、各サンプルの100マイクロリットルを入れ、96ウェルVボトムプレートの1つのウェルに制御します。洗浄用のEDTAの2ミリモルを含むPBSの150マイクロリットルを加えます。
色補償のために、各色のためのコニディアなし100万個の細胞をプレートの他の井戸に置きます。訓練を受けていないままになる細胞の井戸を含めます。洗浄用の各ウェルに、EDTAの2ミリモルを含むPBSの150マイクロリットルを加えます。
次に、粘着ホイルでプレートを覆い、遠心分離機をGの300倍、室温で5分間覆います。その後、ホイルを取り除き、シンクまたは使い捨てのペーパータオルの上に一度だけ素早く強引にプレートを反転させることで上清を捨てます。100マイクロリットルの抗体ミックスで細胞を再懸濁し、ピペット処理でよく混ぜます。
色補償のために、EDTAの2ミリモルを含むPBSの100マイクロリットルのそれぞれの細胞を再懸濁し、抗体ミックスで使用される同じ量で各ウェルに単一の抗体タイプを加える。粘着ホイルで覆い、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。この後、ホイルを取り除き、洗浄のために各ウェルにEDTAの2ミリモルを含むPBSの150マイクロリットルを加えます。
もう一度粘着ホイルでプレートを覆います。遠心分離機はGの300倍、室温で5分間。その後、ホイルを取り出し、シンクまたは使い捨てのペーパータオルの上にプレートを素早く強引に反転させることで上清を捨てます。
2ミリモルEDTAを含むPBSの200マイクロリットルの細胞を再懸濁し、各ウェルから細胞懸濁液を別々の丸底管に移す。フローサイトメーターを開始し、ウォームアップさせます。取得ソフトウェアで、新しい実験を作成し、新しいサンプルを設定してラベル付けします。
テキスト プロトコルで説明されているように、適切な蛍光器のパラメータと検出器を設定します。このソフトウェアでは、テキストプロトコルで概説されているように、適切なドットプロットを表示します。サンプルのみを使用して、いくつかの細胞を取得し、白血球の周りにゲートを設定します。
白血球ゲートに基づいて、CD45陽性細胞用のゲートは、SSC CD45プロット中のコニディアから分離する。ドットプロットにおいて、CD14、CD66b、ゲート好中球および単球は別々に。この後、細胞のみをサンプルから、ラベルなしのConidiaに変更する。
ドットプロットでは、アンチFITC、APC FITCは、アンチFITC、およびFITC信号の設定象限に好中球を表示します。統計ビューを開き、四分の一の四分の一を調整して、クアドラントのセルの最大 1%を使用できるようにします。単球ゲートに対してこのプロセスを繰り返します。白血球ゲートでは、少なくとも20,000のイベントですべてのサンプルを記録します。
ヒト好中球によるFITC標識コニディアの貪食細胞症は、統計図から読み取ることができる。本研究では、高速フローサイトメトリック法を用いて、多数の原発性ヒト白血球とのアスペルギルス・フミガトゥール・コニディアの相互作用を測定する。ここに示す適切な抗体および格子戦略を用いて、FSCおよびSSC特性によるヒト白血球の一般的な格子化は、遊離コニディアにおける白血球の分離に続き、パン白血球マーカー、CD45によって行う。
Conidiaは、フローサイトメトリーの時点で、特に腫れたコニディアを使用する場合、または長いインキュベーション時間を使用すると、ほぼ細胞サイズに達することができ、したがって、私たちの分析を購入することができます。ヒトの一次単球と好中球は異なる方法でConidiaを取るので、このプロトコルは、確立された細胞系統マーカー、単球のCD14、好中球のためのCD66bで染色することに基づいて、これらの細胞集団の別々の分析を可能にする。コニディアを内在化するヒト原発食細胞の割合は、献血者の間で非常に変動する可能性があるが、また、インキュベーション時間およびコニディアの腫脹状態などの実験的要因に依存する。
胞子の内在化は、共培養の0.5時間後に検出することができ、時間とともに増加する。腫脹前のコニディアは、短い孵化時でさえ、胞子を休ませるよりも簡単に取り上げられる。コニディアがホルムアルデヒドで固定されている場合、食道はネイティブコニディアと比較して減少する。
この手順に従って、共インキュベート免疫細胞とConidiaの上清を収集し、その相互作用が免疫細胞によるサイトカイン放出を引き起こすかどうかを確認するために、Elizaによって分析することができる。人間の血液は感染症を伝染させる可能性があります。この作業では、B型肝炎全体のワクチン接種、バイオセーフティキャビネットの使用、ラボコートでの手袋の着用が必要です。
