هذا البروتوكول مهم لأنه يقيس كميا phagocytosis من المسمى Aspergillus fumigateurs Conidia بواسطة الكريات البيض البشرية، جنبا إلى جنب مع تعلق كونيديا إلى الخلايا، وعدم التفاعل عن طريق تدفق الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يسهل التحليل السريع لعدد كبير من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح وضع علامات الخلية بفصل تقييم العدلات والوحديات داخل نفس العينة.
في أي يمكن استخدام هذه التقنية لتحليل الفطريات الأخرى ذات الصلة السريرية مثل Mucorales. بدلا من ذلك قد تستخدم خلايا الدم الحمراء والبلعات. لبدء هذا الإجراء، الرطب منشفة ورقية مع مطهر، ووضعها في مجلس الوزراء السلامة الحيوية.
وضع لوحة من نمت Aspergillus fumigatus على رأس منشفة ورقية لمنع الإفراط في توزيع كونيديا متقلبة. إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.01٪ المنظفات على رأس الفطريات، واستخدام ملعقة Drigalski لنشر السائل على لوحة، وفرك قبالة كونيديا الملونة الداكنة. نقل تعليق كونيديا إلى 50 ملليلتر من خلال مصفاة 30 ميكرومتر, والتي سوف إزالة أي mycelia المتبقية.
إضافة 10 ملليلتر آخر من برنامج تلفزيوني مع المنظفات إلى لوحة، ونشرها مع ملعقة، ونقلها إلى نفس الأنبوب من خلال مصفاة. المقبل، وإعداد حل معقمة من 0.1 كربونات الصوديوم الضرس، حل في برنامج تلفزيوني. وإعداد حل 0.1 ملليمولار من مسحوق FITC، في هذا المحلل كربونات الصوديوم.
إعادة تعليق 100 مليون أو أقل كونيديا, في خمسة ملليلتر من هذا الحل FITC, في أنبوب 15 ملليلتر. احتضان في دوار في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لتضخم إلى كونيديا، resuspend فيتك المسمى كونيديا في خمسة ملليلتر من متوسطة RPMI، تكمل مع 10٪ FCS.
واحتضان في دوار في 37 درجة مئوية للوقت المطلوب. في خزانة السلامة الحيوية، ضع خمسة ملليلترات من المعطف البافي في أنبوب 50 ملليلتر. ملء أنبوب مع عازلة EL، وعكس ثلاث مرات.
احتضان أفقيا لمدة خمس إلى ثماني دقائق، حتى ظهور حليبي من الخليط يتحول واضحة. ثم، الطرد المركزي في 300 مرة G، وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تجاهل افراط و resuspend بيليه في ملليلتر واحد من عازلة EL عن طريق الأنابيب.
إضافة 24 ملليلتر آخر من العازلة EL، وعكس الأنبوب عدة مرات. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تجاهل افراط و resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من وسائل الاعلام RPMI, تكملت مع 10٪ FCS.
للبدء، نقل مليوني الكريات البيض وأربعة ملايين من FITC المسمى كونيديا في 1.5 ملليلتر من RPMI تكملها 10٪ FCS، إلى لوحة ثقافة 12-well. وتشمل السيطرة على الخلايا فقط مع عدم كونيديا، والسيطرة على الخلايا مع كونيديا unlaed. احتضان لوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطب، في 37 درجة مئوية للفترة المطلوبة من الوقت.
عند اكتمال الحضانة، استخدم مكشطة الخلايا لحصاد الخلايا، ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر. أولاً، ضع 100 ميكرولترات من كل عينة وتحكم في بئر واحد من لوحة V-القاع 96-well. إضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني يحتوي على اثنين من ملليلتر من EDTA للغسيل.
للحصول على تعويض اللون، وضع مليون خلية دون كونيديا لكل لون، في آبار أخرى من لوحة. وتشمل بئر من الخلايا التي سيتم تركها غير مدربين. إضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني يحتوي على اثنين من ملليلتر من EDTA إلى كل بئر للغسيل.
بعد ذلك، غطي الطبق برقائق لاصقة، وطاردة مركزية بمعدل 300 مرة في درجة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم، إزالة احباط والتخلص من supernatant عن طريق عكس بسرعة وبقوة لوحة مرة واحدة فقط على الحوض، أو منشفة ورقية يمكن التخلص منها. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة، ومزيج جيد عن طريق الأنابيب.
للحصول على تعويضات اللون، resuspend الخلايا المعنية في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على اثنين من مللي ميللي من EDTA، وإضافة نوع واحد من الأجسام المضادة لكل بئر، في نفس الكمية المستخدمة في مزيج الأجسام المضادة. يُغطّى مع رقاقة لاصقة، ويحتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة الرقائق وأضف 150 ميكرولترات من PBS تحتوي على ميليمولار اثنين من EDTA إلى كل بئر للغسيل.
تغطية لوحة مع احباط لاصقة مرة أخرى. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم إزالة احباط، والتخلص من supernatant عن طريق عكس بسرعة وبقوة لوحة على إما بالوعة أو منشفة ورقية يمكن التخلص منها.
resuspend الخلايا في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على 2 ملليمتر EDTA، ونقل تعليق الخلية من كل بئر، إلى أنبوب أسفل جولة منفصلة. بدء تدفق مقياس الدراجات، والسماح لها الاحماء. في برنامج الاكتساب، قم بإنشاء تجربة جديدة، ثم قم بإعداد وتسمية العينات الجديدة.
إعداد المعلمات وأجهزة الكشف عن الفلوروفوريس المناسبة، كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذا البرنامج، عرض رسم نقطة المناسبة كما هو موضح في بروتوكول النص. باستخدام الخلايا عينة فقط، والحصول على بعض الخلايا وتعيين بوابة حول الكريات البيض.
استنادا إلى بوابة الكريات البيض، بوابة للخلايا إيجابية CD45، لفصل من كونيديا في مؤامرة CD45 SSC. في مؤامرة نقطة، CD14، CD66b، العدلات بوابة ومحاديات منفصلة. بعد ذلك، تغيير من الخلايا عينة فقط، إلى كونيديا unlaidied.
في مؤامرة نقطة، المضادة FITC، APC FITC، عرض العدلات في رباعيات مجموعة لإشارات مكافحة FITC، و FITC. افتح عرض الإحصائيات واضبط الأرباع، مع السماح بـ 1٪ كحد أقصى من الخلايا في الأرباع Q1 و Q2 و Q4 كحد أقصى. كرر هذه العملية لبوابة أحادية. في بوابة الكريات البيض، تسجيل جميع العينات مع ما لا يقل عن 20،000 الأحداث.
يمكن قراءة البلعمة من CONIDIA المسمى FITC من قبل العدلات البشرية من وجهات النظر الإحصاءات. في هذه الدراسة، يتم استخدام طريقة تدفق سريع السيتوميتري لقياس تفاعل أسبيرجيلوس تبخير كونيديا مع عدد كبير من الكريات البيض البشرية الأولية. باستخدام الأجسام المضادة المناسبة واستراتيجية الغاءة هو مبين هنا، وهو الغات العام من الكريات البيض البشرية من قبل FSC وسمات SSC، ويتبع فصل الكريات البيض في كونيديا الحرة، من قبل علامة عموم الكريات البيض، CD45.
يمكن أن تصل كونيديا حجم الخلية تقريبا في وقت تدفق القياس الخلوي، وخاصة عند استخدام Conidia منتفخة، أو فترة حضانة طويلة، وبالتالي يمكن أن تشتري لنا التحليل. منذ أحاديات الإنسان الأساسية والعدلات تناول Conidia بشكل مختلف، وهذا البروتوكول يسمح لتحليل منفصل من هذه الخلايا السكانية على أساس، على تلطيخ مع علامات نسب الخلايا الراسخة، CD14 ل monocytes، وD66b للعدلات. يمكن أن تكون النسبة المئوية للباترات الأولية البشرية التي تُستوعب كونيديا متغيرة للغاية بين المتبرعين بالدم ، ولكنها تعتمد أيضًا على عوامل تجريبية ، مثل وقت الحضانة وحالة التورم في Conidia.
يمكن الكشف عن استيعاب البوغ بعد 0.5 ساعة من الحضانة المشتركة ، ويزيد مع مرور الوقت. يتم تناول كونيديا ما قبل التورم أسهل من جراثيم الراحة ، حتى في أوقات الحضانة القصيرة. إذا تم إصلاح كونيديا مع الفورمالديهايد، يتم تقليل البلعوم مقارنة Conidia الأصلي.
بعد هذا الإجراء، يمكن جمع super من الخلايا المناعية المشتركة وكونيديا وتحليلها من قبل إليزا للتحقق مما إذا كان التفاعل يثير إطلاق السيتوكين من قبل الخلايا المناعية. يرجى تذكر، يمكن أن الدم البشري يحتمل أن تنقل الأمراض المعدية. يتطلب هذا العمل التطعيم عبر التهاب الكبد B، واستخدام خزانة السلامة الحيوية، بالإضافة إلى ارتداء القفازات في معطف المختبر.
