Este protocolo é significativo porque mede quantitativamente a fagocitose do rótulo Aspergillus fumigateurs Conidia por leucócitos humanos, juntamente com a fixação de Conidia às células, e a falta de interação por citometria de fluxo. A principal vantagem deste método é que ele facilita a análise rápida de um grande número de células. Além disso, a rotulagem dos marcadores celulares permite separar a avaliação de neutrófilos e monócitos dentro da mesma amostra.
Em qualquer técnica, essa técnica pode ser usada para analisar outros fungos clínicos relevantes, como mucorales. Em vez disso, glóbulos vermelhos podem ser usados como fagocitos. Para começar este procedimento, molhe uma toalha de papel com desinfetante e coloque-a em um armário de bio segurança.
Coloque um prato de Aspergillus fumigatus crescido em cima da toalha de papel para evitar a super distribuição da Conidia volátil. Adicione 10 mililitros de PBS contendo 0,01% de detergente em cima do fungo, e use uma espátula Drigalski para espalhar o líquido sobre a placa, e esfregue a Conidia de cor escura. Transfira a suspensão conidia para um 50 mililitro através de um coador de 30 micrômetros, que removerá qualquer micélia residual.
Adicione mais 10 mililitros de PBS com detergente à placa, espalhe-o com uma espátula e transfira-o para o mesmo tubo através do coador. Em seguida, prepare uma solução estéril de carbonato de sódio molar 0.1, dissolvido em PBS. E prepare uma solução de 0,1 milimiliar de pó FITC, nesta solução de carbonato de sódio.
Suspenda 100 milhões ou menos de Conidia, em cinco mililitros desta solução FITC, em um tubo de 15 mililitros. Incubar em uma rotadora a 37 graus Celsius por 20 minutos. Para inchar até Conidia, resuspenque o FITC rotulado conidia em cinco mililitros de meio RPMI, complementado com 10% de FCS.
E incubar em uma rotadora a 37 graus Celsius pelo tempo desejado. Em um armário de bio segurança, coloque cinco mililitros de casaco buffy em um tubo de 50 mililitros. Encha o tubo com tampão EL e inverta três vezes.
Incubar horizontalmente por cinco a oito minutos, até que a aparência leitosa da mistura fique clara. Em seguida, centrífuga a 300 vezes G, e à temperatura ambiente por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em um mililitro de tampão EL por pipetação.
Adicione mais 24 mililitros de tampão EL e inverta o tubo várias vezes. Centrifugar a 300 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Descarte o supernasce e resuspenque as células em um mililitro de mídia RPMI, complementada com 10% de FCS.
Para começar, transfira dois milhões de leucócitos e quatro milhões de Conidia com a etiqueta FITC em 1,5 mililitros de RPMI complementados com 10% de FCS, para uma placa de cultura de 12 poços. Inclua um controle de células apenas sem Conidia, e um controle de células com Conidia não rotulada. Incubar a placa em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada, a 37 graus Celsius pelo tempo desejado.
Quando a incubação estiver completa, use um raspador de células para colher as células e transfira-as para um tubo de 15 mililitros. Primeiro, coloque 100 microliters de cada amostra e controle em um poço de uma placa de fundo V de 96 poços. Adicione 150 microliters de PBS contendo dois milimões de EDTA para lavagem.
Para compensação de cores, coloque um milhão de células sem Conidia para cada cor, em outros poços da placa. Inclua um poço de células que serão deixadas sem treinamento. Adicione 150 microliters de PBS contendo dois milimões de EDTA em cada poço para lavagem.
Em seguida, cubra a placa com uma folha adesiva, e centrífuga a 300 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, remova a folha e descarte o supernaspetivo invertendo rapidamente e com força a placa apenas uma vez sobre a pia, ou uma toalha de papel descartável. Resuspend as células em 100 microliters de mistura de anticorpos, e misture bem por pipetação.
Para compensações de cores, resuspenja as respectivas células em 100 microliters de PBS contendo dois milimões de EDTA, e adicione um único tipo de anticorpo a cada poço, na mesma quantidade utilizada na mistura de anticorpos. Cubra com uma folha adesiva e incubar à temperatura ambiente no escuro por 20 minutos. Depois disso, remova a folha e adicione 150 microliters de PBS contendo dois milimões de EDTA em cada poço para lavagem.
Cubra a placa com papel alumínio adesivo novamente. Centrifugar a 300 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, remova a folha e descarte o supernaspetivo invertendo rapidamente e com força a placa sobre uma pia ou uma toalha de papel descartável.
Resuspend as células em 200 microliters de PBS contendo 2 milimolalares EDTA, e transfira a suspensão celular de cada poço, em um tubo de fundo redondo separado. Inicie o citómetro de fluxo e deixe aquecer. No software de aquisição, crie um novo experimento e configure e rotule as novas amostras.
Configure os parâmetros e os detectores para os fluoroforos apropriados, conforme descrito no protocolo de texto. Neste software, exiba os gráficos de ponto apropriados conforme descrito no protocolo de texto. Usando apenas as células amostra, adquira algumas células e coloque o portão em torno de leucócitos.
Com base no portão leucócito, portão para células positivas CD45, para separar-se da Conidia na trama SSC CD45. Em um gráfico de pontos, CD14, CD66b, neutrófilos de portão e monócitos separadamente. Depois disso, mude de amostra apenas das células, para Conidia não rotulada.
Em um gráfico de pontos, anti-FITC, APC FITC, exibem neutrófilos em quadrantes definidos para sinais anti-FITC e FITC. Abra a visão estatística e ajuste os quadrantes, permitindo um máximo de 1% das células nos quadrantes Q1, Q2 e Q4. Repita este processo para o portão de monócito. No portão de leucócitos, registos com pelo menos 20.000 eventos.
A fagocitose da Conidia rotulada pelo FITC por neutrófilos humanos pode ser lida a partir das visões estatísticas. Neste estudo, um método citométrico de fluxo rápido é usado para medir a interação de Aspergillus fumigateurs Conidia com um grande número de leucócitos humanos primários. Utilizando os anticorpos apropriados e a estratégia de gating aqui mostrada, um gating geral de leucócitos humanos pelas características do FSC e do SSC, é seguido por uma separação de leucócitos em Conidia livre, pelo marcador de leucócito pan, CD45.
A conidia pode atingir quase o tamanho da célula no momento da citometria de fluxo, especialmente quando se usa Conidia inchada, e ou longos tempos de incubação, e assim pode nos comprar análises. Uma vez que monócitos primários humanos e neutrófilos tomam Conidia de forma diferente, este protocolo permite a análise separada dessas células baseadas, na coloração com os marcadores de linhagem celular bem estabelecidos, CD14 para monócitos e CD66b para neutrófilos. O percentual de fagocitos primários humanos internalizando a Conidia pode ser altamente variável entre os doadores de sangue, mas também depende de fatores experimentais, como tempo de incubação e estado de inchaço da Conidia.
A internalização do esporo pode ser detectada após 0,5 horas de co-incubação, e aumenta com o tempo. Conidia pré-inchada são tomadas mais fácil do que esporos de descanso, mesmo em curtos períodos de incubação. Se a Conidia for fixada com formaldeído, a fagocitose é diminuída em comparação com a Conidia nativa.
Após este procedimento, supernacantantes de células imunes co-incubadas e Conidia podem ser coletados e analisados por Eliza para verificar se a interação provoca uma liberação de citocina pelas células imunes. Por favor, lembre-se, o sangue humano pode potencialmente transmitir doenças infecciosas. Este trabalho requer a vacinação em toda a Hepatite B, o uso de um armário de bio segurança, bem como o uso de luvas em um jaleco.
