Este protocolo describe la producción de células T inmunoterapéuticas rhesus que expresan dos proteínas: un receptor de antígeno quimérico antiviral y un receptor de quimiocina CXCR5 que ataca las células a los folículos linfoides. Este procedimiento relativamente rápido de nueve días produce células T con fenotipo de memoria central menos diferenciado con el potencial de persistente a largo plazo después de la infusión en animales. La adaptación de este método a las células humanas permitirá la producción de células T inmunoterapéuticas con el potencial de inducir una remisión duradera al VIH sin la administración de medicamentos antirretrovirales.
Este método se puede utilizar ampliamente para producir células T rhesus que expresan otras proteínas de interés. Y con pequeñas modificaciones, se puede utilizar para generar células T transducidas en otras especies, incluyendo los seres humanos. El éxito de la transducción depende de los PBMC estimulados saludables.
Se debe tener cuidado en la recolección, el transporte y el almacenamiento. Antes de la transducción, es importante evaluar visualmente la estimulación de las células. Comience descongelando los PBMC rhesus primarios.
Incubar las células en un baño de agua de 37 grados Celsius con agitación suave hasta que sólo quede una pequeña cantidad de hielo. Pipetear suavemente las células en un tubo cónico. A continuación, enjuague el vial con un mililitro de medio básico y agréguelo lentamente a las células.
Agregue lentamente nueve mililitros adicionales de medio básico caliente a las células. Coloque el tubo en el recipiente resistente al aerosol y centrifugarlo a 600 g durante cinco minutos a 22 grados centígrados. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en una pequeña cantidad de medio de crecimiento.
Para contar las células, agregue 10 microlitros de células a 10 microlitros de color azul tripano. Cargue la corredera de la cámara e insértela en el mostrador. Presione el botón de captura para contar las celdas.
Calcular el número total de células multiplicando la concentración celular por volumen y diluirlas a dos millones de células por mililitro en medio de crecimiento. Añadir anti-CD28 para una concentración final de cinco microgramos por mililitro. Luego pipetear de tres a seis millones de células por pozo en placas recubiertas anti-CD3.
Incubar las placas durante dos días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Caliente una centrífuga a 32 grados centígrados ejecutándola a 2.000 veces g durante unos 30 minutos. Mientras tanto, calienta los medios libres de suero como los de crecimiento en un baño de agua de 37 grados Celsius y descongela el virus con suaves remolinos en un baño de agua de 37 grados Centígrados.
A continuación, colóquelo en hielo. Diluir el virus a una multiplicidad óptima predeterminada de infección en medio libre de suero. Añadir dos mililitros del retrovirus diluido a cada pozo de la placa recubierta de fibronectina utilizando medios solo para las células de control negativas.
Coloque las placas en la centrífuga precalentada en soportes de microplacas y centrifugarlas a 2.000 g durante dos horas. Si se utiliza inmediatamente, aspirar la preparación del virus de los pozos y añadir dos mililitros de medio de crecimiento. Compruebe los PBMC estimulados bajo un microscopio invertido.
Las células deben ser redondas, brillantes, y deben refractar la luz. También deben tener una apariencia agujenada que indique la estimulación. Recoger las células de destino y transferirlas a un tubo cónico de 50 mililitros.
Enjuagar cada pozo una vez con un mililitro de medio de crecimiento y añadirlo al tubo. A continuación, cuente las celdas como se ha demostrado anteriormente. Peletiza las células centrifugando a 600 veces g durante cinco minutos a 32 grados centígrados.
Aspirar los medios del pellet y resuspender las células en medio de crecimiento a una concentración de 1,5 millones de células por mililitro. Añadir un mililitro de la suspensión celular a cada pozo recubierto de virus y añadir células de transducción MAC a los pozos recubiertos con fibronectina que no recibieron virus. Centrifugar las placas a 1.000 g durante 10 minutos a 32 grados centígrados e incubarlas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
El trabajo con células rhesus y gamma retrovirus requiere el uso de equipos de protección personal como abrigos y guantes de laboratorio y el trabajo debe llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad. Todas las pipetas y soluciones deben ser descontaminadas. Pipetear el contenido de cada pozo arriba y abajo con una pipeta de cinco mililitros para resuspender las células y transferirlas a un tubo cónico de 50 mililitros.
Añadir un mililitro de medio de crecimiento a cada pozo y pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar las células adherentes. A continuación, cuente las celdas como se describió anteriormente. Centrifugar las células a 600 veces g durante 10 minutos a 25 grados centígrados.
Luego aspirar los medios y resuspender las células en medios de expansión a una concentración de un millón de células por mililitro. Siembra cinco mililitros de células en cada pozo permeable al gas de una placa de seis pozos y coloca cuidadosamente una capa adicional de 25 mililitros de medios de expansión por pozo. Luego incubar las células sin perturbar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro días.
Para recoger las células de los pozos, retire y deseche 20 mililitros de los medios teniendo cuidado de no molestar a las células. Pipetear el medio restante arriba y abajo para desalojar las células. Utilice una pipeta de transferencia estéril para enjuagar cada pozo con tres mililitros de medios y recoger las células residuales.
A continuación, contarlos para comprobar el número de celda y la viabilidad. Este protocolo se utilizó para la transducción y expansión de células de seis animales diferentes. Los pozos permeables al gas se sembraron a una densidad inicial de cinco millones de células y después de cuatro días de crecimiento, se logró una densidad media de 55,6 millones de células por pozo.
La viabilidad de las células monitoreadas por la exclusión azul de tripano se mantuvo entre el 83 y el 95% en todo el protocolo. La citometría de flujo se utilizó para observar la coexpresión de los genes transducidos. En el quinto día, una mediana del 42,8% de las células fueron transducidas con CD4-MBL CAR y CXCR5.
Mientras que en el día nueve, la expresión mediana fue del 47,6% con una sola ronda de transducción. La citometría de flujo también se utilizó para monitorear el fenotipo de memoria. Antes de la transducción y la expansión, se identificaron poblaciones ingenuas de memoria central y memoria de efector.
La población ingenua se perdió con el cultivo y las células eran principalmente células de memoria central para el día cinco y el día nueve. El éxito en la transducción depende del uso de reactivos de alta calidad, células altamente viables y virus valorados, así como de manera consistente siguiendo el momento del protocolo. Las células se pueden utilizar para ensayos funcionales, incluidos ensayos de migración y supresión viral, así como para la perfusión en animales para estudios preclínicos para probar la eficacia de la inmunoterapia.
Hemos avanzado con las pruebas preclínicas de células T CAR y CXCR5 en animales y esperamos probar pronto esta inmunoterapia en individuos infectados por el VIH.
