Questo protocollo delinea la produzione di cellule T rhesus immunoterapeutiche che esprimono due proteine: un recettore antivirale dell'antigene chimerico e un recettore delle chemiochine CXCR5 che indirizzano le cellule ai follicoli linfoidi. Questa procedura relativamente rapida di nove giorni produce cellule T con fenotipo di memoria centrale meno differenziato con il potenziale di persistente a lungo termine dopo l'infusione negli animali. L'adattamento di questo metodo alle cellule umane consentirà la produzione di cellule T immunoterapeutiche con il potenziale di indurre una remissione duratura all'HIV senza somministrazione di farmaci antiretrovirali.
Questo metodo può essere usato ampiamente per produrre cellule T rhesus che esprimono altre proteine di interesse. E con piccole modifiche, può essere usato per generare cellule T trasdotto in altre specie, compresi gli esseri umani. Il successo della trasduzione dipende da PBPC stimolati sani.
Occorre prestare attenzione alla raccolta, al trasporto e all'archiviazione. Prima della trasduzione, è importante valutare visivamente la stimolazione delle cellule. Iniziare scongelando i PBPC rhesus primari.
Incubare le cellule in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius con delicata agitazione fino a quando rimane solo una piccola quantità di ghiaccio. Pipettare delicatamente le cellule in un tubo conico. Quindi sciacquare la fiala con un millilitro di mezzo di base e aggiungerla lentamente alle cellule.
Aggiungere lentamente altri nove millilitri di mezzo di base caldo alle cellule. Posizionare il tubo nel contenitore resistente agli aerosol e centrifugarlo a 600 volte g per cinque minuti a 22 gradi Celsius. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in una piccola quantità di mezzo di crescita.
Per contare le cellule, aggiungere 10 microlitri di cellule a 10 microlitri di tripano blu. Caricare la diapositiva della camera e inserirla nel contatore. Premere il pulsante di acquisizione per contare le celle.
Calcolare il numero totale di cellule moltiplicando la concentrazione cellulare per volume e diluirle a due milioni di cellule per millilitro nel mezzo di crescita. Aggiungere anti-CD28 per una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro. Quindi pipettare da tre a sei milioni di celle per pozzo in piastre rivestite anti-CD3.
Incubare le piastre per due giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Riscaldare una centrifuga a 32 gradi Celsius eseguendola a 2.000 volte g per circa 30 minuti. Nel frattempo, riscaldare sia i mezzi senza siero che i mezzi di crescita in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e scongelare il virus con un delicato vortice in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.
Allora mettilo sul ghiaccio. Diluire il virus in una molteplicità ottimale predeterminata di infezione in mezzo privo di siero. Aggiungere due millilitri del retrovirus diluito ad ogni pozzo della piastra rivestita con fibronectina usando il solo supporto per le celle di controllo negative.
Posizionare le piastre nella centrifuga prebelliche in supporti di micropiatta e centrifugarle a 2.000 volte g per due ore. Se si utilizza immediatamente, aspirare la preparazione del virus dai pozzi e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita. Controllare i PBBC stimolati al microscopio invertito.
Le cellule dovrebbero essere rotonde, luminose e dovrebbero rifratre la luce. Dovrebbero anche avere un aspetto raggruppato che indica la stimolazione. Raccogliere le cellule bersaglio e trasferirle in un tubo conico da 50 millilitri.
Risciacquare ogni bene una volta con un millilitro di mezzo di crescita e aggiungerlo al tubo. Quindi contare le celle come dimostrato in precedenza. Pellettare le cellule centrifugandole a 600 volte g per cinque minuti a 32 gradi Celsius.
Aspirare il mezzo dal pellet e rimospendare le cellule nel mezzo di crescita ad una concentrazione di 1,5 milioni di cellule per millilitro. Aggiungere un millilitro della sospensione cellulare a ciascun pozzo rivestito di virus e aggiungere le cellule trasduttrici MAC ai pozzi rivestiti di fibronectina che non hanno ricevuto virus. Centrifugare le piastre a 1.000 volte g per 10 minuti a 32 gradi Celsius e incubarle a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore.
Il lavoro con le cellule rhesus e i retrovirus gamma richiede l'uso di dispositivi di protezione individuale come cappotti e guanti da laboratorio e il lavoro deve essere eseguito in un armadio per la biosicurezza. Tutte le pipette e le soluzioni devono essere decontaminate. Pipettare il contenuto di ogni pozzo su e giù con una pipetta da cinque millilitri per rimospendare le celle e trasferirle in un tubo conico da 50 millilitri.
Aggiungere un millilitro di mezzo di crescita a ciascun pozzo e pipettare su e giù per rimuovere le cellule aderenti. Quindi contare le celle come descritto in precedenza. Centrifugare le cellule a 600 volte g per 10 minuti a 25 gradi Celsius.
Quindi aspirare il supporto e rimosombiare le cellule nei mezzi di espansione a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro. Sementire cinque millilitri di celle in ogni pozzo permeabile al gas di una piastra a sei pozza e stratificazione con cura di altri 25 millilitri di mezzi di espansione per pozzo. Quindi incubare le cellule indisturbate a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro giorni.
Per raccogliere le cellule dai pozzi, rimuovere e scartare 20 millilitri del supporto facendo attenzione a non disturbare le cellule. Pipettare il supporto rimanente su e giù per spostare le celle. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per risciacquare ogni bene con tre millilitri di supporto e raccogliere le cellule residue.
Quindi contali per verificare il numero di cella e la vitalità. Questo protocollo è stato utilizzato per la trasduzione e l'espansione di cellule da sei diversi animali. I pozzi permeabili al gas sono stati seminati ad una densità iniziale di cinque milioni di cellule e dopo quattro giorni di crescita è stata raggiunta una densità mediana di 55,6 milioni di cellule per pozzo.
La vitalità delle celle monitorate dall'esclusione blu del tripano è stata mantenuta dall'83 al 95% in tutto il protocollo. La citometria a flusso è stata usata per osservare la co-espressione dei geni trasdotti. Il quinto giorno, una mediana del 42,8% delle celle è stata trasdutta sia con CD4-MBL CAR che con CXCR5.
Mentre il nono giorno, l'espressione mediana era del 47,6% con un singolo ciclo di trasduzione. La citometria a flusso è stata utilizzata anche per monitorare il fenotipo di memoria. Prima della trasduzione e dell'espansione, erano identificate popolazioni ingenue di memoria centrale ed effettore.
La popolazione ingenua fu persa con la ristrutturazione e le cellule erano principalmente cellule di memoria centrale al quinto e al nono giorno. Il successo nella trasduzione dipende dall'uso di reagenti di alta qualità, cellule altamente vitali e virus titolato, oltre a seguire costantemente i tempi del protocollo. Le cellule possono essere utilizzate per test funzionali tra cui test di migrazione e soppressione virale, nonché per l'infusione negli animali per studi preclinici per testare l'efficacia dell'immunoterapia.
Siamo andati avanti con i test preclinici delle cellule T CAR e CXCR5 negli animali e speriamo di testare presto questa immunoterapia negli individui infetti da HIV.
