Complejo de tejidos multicelulares, este protocolo reconstituye la conducta celular de una manera simplificada. Una cosa es esta técnica para estudiar las relaciones directas entre los protones del conductor celular y la respuesta celular. Este protocolo utiliza cuentas de poliestireno químicamente funcionales para reconstituir los protones del conductor celular.
Las cuentas se pueden cortar con cualquier protón de interés, para probar sus efectos en la respuesta celular. Hemos utilizado este método en C-Elegance en embriones de ratón. Por lo tanto, este protocolo puede ser vertical a los estudios de organismos anchos.
Como los embriones son frágiles después de un tratamiento de clorito completo alto, se requiere una práctica significativa antes de que se pueda aislar con éxito el blastomere. La demostración visual proporcionará una mayor comprensión de cómo se debe manejar el capilar durante los métodos de aislamiento de blastomere. Para empezar, pesa 10 mili-gramos de perlas de poliestireno modificado carboxilato en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros.
Agregue un mililitro de tampón MES en el tubo para lavar. Vórtice el tubo para mezclar las cuentas. Gire el tubo durante 60 segundos a 2000XG a través de la centrífuga de sobremesa.
Dicard el sobrenadante pipetando cuidadosamente el búfer. Lave las cuentas de nuevo con un milivali litro de tampón MES. Después del lavado, agregue un mililitro de tampón MES que contenga 10 mili-gramos de EDAC en el tubo, para activar los grupos carboxilo de superficie.
Vórtice el tubo para mezclar las cuentas. Gire e incubar el tubo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Gire hacia abajo las perlas durante 60 segundos a 2000XG.
Deseche el sobrenadante con una cuidadosa descontaje del tampón y lave con un miliva litro de PBS. Vórtice el tubo para mezclar las perlas y repetir el PBS lavar una vez más. Prepare un mililitro de uno, 10, 100 y mil veces la serie de dilución de Rhodamine Red-X de la solución de 0,65 mililitros de Rhodamine Red-X.
Pippette 20 micro litros de perlas en cada tubo de dilución serie. Gire e incubar los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lave las cuentas dos veces con un milivali litro de PBS.
Después del lavado, agregue un mililitro de PBS en los tubos y guárdelos a cuatro grados centígrados durante un máximo de seis semanas. Compruebe la intensidad de fluorescencia de las perlas bajo un microscopio utilizado para la toma de imágenes en vivo. Sostenga cada extremo de un micro-capilar a una capacidad de 10 micro litros con la mano derecha e izquierda.
Tire del micro-capilar hacia ambos extremos para aplicar tensión y llevar el centro del capilar sobre un quemador para hacer dos capilares tirados a mano. Bajo el microscopio de disección, recortar las puntas de los capilares tirados a mano con fórceps. Haga los dos tamaños de apertura de punta aproximadamente dos veces, y una vez la corta longitud de acceso de los embriones C-Elegance para la transferencia de embriones y la eliminación de cáscara de huevo respectivamente.
Fije el capilar tirado en un aparato de tubería de boca. Pippette 45 micro litros de solución de sales de huevo en un pozo de un portaobjetos multi-welled. Coloque de cinco a 10 C-Elegance para adultos en el pozo.
Para obtener los primeros C-Elegance Embryos cortar a los adultos en pedazos colocando dos agujas a la derecha y a la izquierda del cuerpo de C-Elegance, y deslizando las agujas unas sobre otras. Pippette 45 micro litros de solución de hipoclorito en un pozo junto a la solución de huevo-sal que contiene bien y pippette 45 micro litros de Shelton's Growth Medium en los tres pozos posteriores. Transfiera una etapa celular y los embriones de dos etapas tempranas a la solución de hipoclorito por la boca pippette con la abertura de mayor tamaño y espere de 40 a 55 segundos.
Lave los embriones transfiriéndolos a los siguientes tres pozos con Shelton's Growth Medium. Con uno o dos segundos en cada uno de los dos primeros pozos. Usando el capilar dibujado a mano con la abertura de menor tamaño repita cuidadosamente la tubería del embrión para la eliminación de la cáscara de huevo.
Después de eso, pippeta continuamente con el capilar dibujado a mano para separar los blastomeros embrionarios de dos celdas. Después de la eliminación de la cáscara de huevo, minimice la fuerza en la pipte de los embriones hacia arriba y hacia abajo para evitar la explosión. Prepare una cámara de imágenes colocando un cubreobjetos en un soporte de cubreobjetos y pegue los bordes del cubreobjetos para estabilizarlo.
Voltee el soporte del cubreobjetos y dibuje un círculo en el cubreobjetos con una pluma hidrófoba. Agregue el medio de crecimiento de Shelton dentro del círculo dibujado por el marcador hidrófobo, y transfiera el blastomere aislado a la cámara de imágenes dentro del círculo. Ahora, dispensar un pequeño volumen de las perlas químicamente funcionalizadas en el cubreobjetos usando el capilar dibujado a mano con la abertura más grande.
Controle la posición de las perlas soplando en el capilar dibujado a mano hasta que las perlas se adhieran al blastomere aislado. Monte el cubreobjetos para evitar la evaporación del medio y realice imágenes en vivo con un microscopio invertido. En este estudio, la señal fluorescente del cordón tratado con 0.005 micro-gramos por milival Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester para la cepa transgénica que expresa la miosina GFP-2 y M-cherihistone era demasiado débil.
Por otro lado, la señal fluorescente de las cuentas tratadas con cinco micro-gramos por miliva-litro Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester era demasiado fuerte. La concentración de Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester en 0.5 micro-gramos por miliva litro fue óptima para esta cepa transgénica en particular. Durante la toma de imágenes en vivo se identificó un plano donde dos centroomas se alinearon verticalmente.
El plano con un ángulo de más o menos de 90 grados de este plano es plano de husillo. El ángulo de orientación del husillo en relación con la interfaz de contacto de celda/perla después de que la citoquinesis muestra que ambas células hijas estaban unidas al cordón en una línea que pasa ambas miras de contacto se utilizó como orientación de contacto. Uno necesita aprender cómo reaccionan los embriones y la cáscara de huevo a ciertas fuerzas externas aplicadas por la pippetta de la boca.
Teóricamente, cualquier respuesta celular se puede estudiar, por ejemplo, especificación de sulfato se puede estudiar mediante el cultivo de células y el contacto con perlas adhesivas en términos más largos. Esta técnica se ha utilizado para comprender el mecanismo de orientación de división de celda dependiente del contacto. El filtro PTF se utilizó para evitar la inhalación de humos de solución de hipoclorito a través de pippette bucal.
