Los asteriscos (*) indican los pasos nuevos o modificados en comparación con Christensen et al. 1 1. Configuración del material <ol><li> El procedimiento de cultivo celular requiere grandes cantidades de huevos aislados de los adultos grávidas. Crecer C. elegans en 8P placas de agar sembrado con NA22 (disponible a través de la C. elegans Consorcio Genético - CGC) bacterias para aislar grandes cantidades de huevos. En estas placas de la cantidad de peptona utilizado es 8 veces la cantidad que se utiliza normalmente para las placas de NGM. La concentración de peptona superior sostiene el crecimiento de bacterias NA22 de manera más eficiente, que contrariamente a OP50-, crecer en capas gruesas. </li></ol> 8P placas de recetas: Disolver 3 g de NaCl, 20 g de Bacto-peptona, 25 g de agar en 1 L de agua destilada estéril y se autoclave durante 30 min. Deje enfriar el medio a 55 ° C y luego añadir-filtrados estériles de 1 ml de colesterol (5 mg / ml en EtOH), 1 ml de 1 MgCl 2, 1 ml de MgSO4 y 25 ml de tampón KP (un balance de 500 ml: 5 g de K 2 HPO 4, 30 g de KH 2 PO 4, pH 6,00). Verter medio de agar líquido en 10 cm de placas de Petri (25 ml / placa). <ol start="2"><li> El día siguiente se extendió toda la superficie de cada placa de agar de peptona enriquecida con 1 ml de E. NA22 coli cultivadas durante la noche en medios 2xYT (16 g de triptona, extracto de 10 g de levadura, 5 g de NaCl en 1 l de agua estéril, pH 7,0) a 37 ° C. Estas bacterias constituyen una fuente de alimento abundante que formará una capa gruesa apoyar el crecimiento de las grandes cantidades de adultos grávidas. Deja placas sembradas durante la noche a temperatura ambiente para permitir el crecimiento de las bacterias. El proceso puede ser acelerado por incubación a 37 ° C durante 4-5 horas. </li><li> Traslado animales murieron de sembradas 8P placas. Lavar los animales fuera de una placa de NGM hambre usando 5-6 ml de tampón M9 o agua y añadir 1-2 ml de esta suspensión a cada placa 8P. </li><li> Permitir el crecimiento y la multiplicación de los animales UNTil las placas se llenan en la confluencia de los adultos grávidas. </li><li> Aislar los huevos necesarios para la preparación de C. Elegans células embrionarias, de adultos grávidas utilizando 5-6 ml de solución de lisis. </li></ol> Receta de solución de lisis 5 ml de lejía fresca, 1,25 ml de NaOH 10 N y 18,5 ml de H2O estéril Esta mezcla debe prepararse antes de cada uso. <ol start="6"><li> Lavar los huevos aislados de los adultos grávidas usando tampón de huevo: </li></ol> Receta búfer Huevo NaCl 118 mM, 48 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl 2, 25 mM de Hepes, pH 7,3, osmolaridad 340 mOsm. <ol start="7"><li> Retire la cáscara de huevo que rodea los huevos por el tratamiento con quitinasa. La quitinasa es una enzima con actividad más alta a pH ácido 25. Disolver quitinasa (Sigma, n º de catálogo. C6137) en tampón de huevo de pH 6,5 a una concentración final de 2 mg / ml. Almacene las acciones quitinasasolución a -20 ° C en alícuotas de 1 ml en tubos de 15 ml cónicos estériles. Las alícuotas se pueden almacenar a -20 ° C hasta unos pocos meses. </li><li> Crecer C. células cultivadas sobre cubreobjetos elegans en autoclave (12 mm de diámetro) cubierto con lectina de cacahuete. Disolver lectina de cacahuete en agua estéril (0,5 mg / ml). Solución de lectina de cacahuete no debe ser filtrada o en autoclave. También no tiene que ser tratada con luz UV. Tienda 2 ml alícuotas a -20 ° C durante un máximo de 6 meses. </li><li> Medio de cultivo celular completo (500 ml) contiene 500 ml de L-15 medio de cultivo de Gibco, 50 ml de suero bovino fetal (inactivado por calor), 7,7 g de sacarosa (45 mOsm), 5 ml de 100 U / ml de penicilina y de 100 g / ml de estreptomicina (2%). El medio completo se filtra a continuación, utilizando un filtro de poro 0,20 micras. </li></ol> Tenga en cuenta que la memoria intermedia de huevo y el medio de cultivo tienen osmolaridad de 340 mOsm y 345, respectivamente. En efecto, contrariamente a las células de mamíferos, C. células elegans tienen una relativamente alta osmolaridadque necesita ser tenido en cuenta al preparar soluciones que estarán en contacto directo con la membrana plasmática de las células. Las recetas de estos reactivos se ajustaron para alcanzar la osmolaridad deseada, que se midió utilizando un osmómetro 1. No es necesario utilizar un osmómetro si estas recetas se siguen con exactitud y cuidado se utiliza en la preparación de estos reactivos. Sin embargo, se debe utilizar un Osmoter si otras soluciones tienen que estar preparados, cuyas recetas no son reportados aquí o en cualquiera de las publicaciones que utilizan C. elegans células cultivadas. 2. Aislamiento Huevo <ol><li> Se recomienda comenzar con al menos cuatro 8P placas para recoger los huevos suficientes para 12 pocillos de células cultivadas (en placas de 24 pocillos). </li><li> Antes de comenzar con el procedimiento de descongelar un tubo de solución de cacahuete lectina de valores. Coloque cubreobjetos tratados en autoclave en la parte inferior de los pocillos en una placa de 24 pocillos y añadir 200 l de lectina de cacahuete a los cubreobjetos. Incubar durante 1 hora o uasta las células están listas para ser chapada. Retire completamente la lectina de cacahuete y lavar los pocillos una vez con 1 ml de agua estéril tratada en autoclave. La eliminación completa de la lectina de cacahuete de los cubreobjetos es esencial para evitar la formación de grumos de células. </li><li> Lave los adultos grávidas de las placas de agar con agua tratada en autoclave estéril. Recoger la suspensión en dos cónica tubo de 50 ml estéril. Dejar los tubos en hielo durante hasta 5 minutos para permitir la precipitación de los gusanos en la parte inferior de los tubos (*). Retire el agua con una pipeta de plástico de transferencia y reemplazarla con agua esterilizada en autoclave fresco. Pellet gusanos sobremesa centrifugación a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min (*). Repita este último paso al menos 3. </li><li> Transferencia de gusanos en un tubo cónico de 15 ml estéril y sedimentar ellos a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min (*). No utilice una mayor velocidad de centrifugación para evitar la recogida de las bacterias en la parte inferior del tubo también. A veces, después centrifugaciones los gusanos no están completamente sedimentan. After de cada lavado y antes de la eliminación del sobrenadante, coloque los tubos durante 5 minutos en hielo. En refrigerada gusanos de agua precipitan a la parte inferior del tubo. </li><li> Retire el agua y añadir 5-6 ml de solución de lisis (ver material creado). Rock the suspensión suavemente durante 5-10 minutos y luego comenzar a supervisar lisis gusano bajo el microscopio estereoscópico, cada 2-3 min. Una gota de la suspensión puede ser también colocado en un cubreobjetos para la inspección fácil. El tiempo de incubación varía en función de la frescura de la lejía, comprar pequeñas botellas de lejía y abrir una botella nueva cada mes. </li><li> Cuando ~ 70-80% de los gusanos se lisan (10 min desde el comienzo de la incubación), detener la reacción de lisis mediante la adición de 9 ml de tampón de huevo de pH 7,3 (ver Material SET UP). Centrifugar la suspensión a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min. A partir de ahora tendrá un mechero Bunsen en adelante, en el banco para evitar una nueva contaminación de los huevos (*). </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de plástico estéril y lavar el pellet 3-4x con tampón de huevo hasta que la solución es clara. Asegúrese de mezclar bien el sedimento en el tampón de huevos durante cada lavado. </li><li> Los huevos se separan de los cadáveres de animales utilizando solución de sacarosa al 30%. Resuspender el sedimento en 2 ml de tampón de huevo estéril y añadir solución de sacarosa al 2 ml de 60% (en tampón de stock huevo estéril). Mezclar bien y centrifugar durante 20 min a 200 xg (~ 1200 rpm) (*). </li><li> Retire con cuidado los tubos de la centrífuga. Los huevos están flotando en la parte superior de la solución. Usando una pipeta P1000 y puntas de pipetas estériles, transferir todos los huevos en un tubo cónico frescas 15 ml estériles. </li><li> Añadir 10 ml de tampón de huevo estéril para el tubo y centrifugar a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min. Repita el lavado 3 x. Asegúrese de que los huevos estén totalmente resuspendidas en el tampón de huevos durante cada lavado. </li></ol> 3. Células embrionarias de disociación Llevar a cabo los siguientes pasos del procedimiento en condiciones estériles utilizando una campana de flujo laminar. Mientras que los animales sonel vestido en placas de bacterias, los lavados y el tratamiento con la solución de lisis que contiene blanqueador debería eliminar la mayoría si no todas las bacterias. Por lo tanto el uso de una campana laminar en este punto del procedimiento evita nueva contaminación de la suspensión de huevos. <ol><li> Resuspender huevos sedimentadas en 1 ml de 2 mg / ml quitinasa (existencias en tampón de huevo pH 6,5 (*)) y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 15 ml estéril. Roca el tubo de 10-30 minutos a temperatura ambiente. La hora exacta de incubación varía de acuerdo con la frescura de la enzima y la temperatura de la habitación y por lo tanto debe determinarse para cada preparación. Se recomienda iniciar la supervisión de los huevos en un microscopio invertido de cultivo celular después de 10 minutos de incubación. Nota: en nuestra experiencia, el bajo pH aumenta la actividad enzimática quitinasa. Por esta razón se utiliza tampón de huevo a pH 6,5 para disolver quitinasa (receta se informó anteriormente, donde el pH se ajusta a 6,5 ​​usando NaOH). </li><li> Cuando ~ 80% de las cáscaras de huevo son digeridos por latratamiento quitinasa (Figuras 1 AB), que sedimenten los huevos por centrifugación a 900 xg (~ 2500 rpm) durante 3 min (*). Usando una pipeta P1000 y puntas esterilizadas, retire con cuidado el sobrenadante y añadir 3 ml de medio L-15 (*). </li><li> La transferencia de los huevos en un plato de 6 cm de diámetro y disociar suavemente las células utilizando una jeringa estéril de 10 ml equipado con una aguja de calibre 18. Monitorear el grado de disociación mediante la colocación de una gota de suspensión en un placa Petri de plástico fresco y por ver bajo el microscopio. No aspirar aire en la jeringa durante este procedimiento para evitar dañar las células. Continuar la disociación hasta ~ 80% de las células se disocian. </li><li> Filtrar la suspensión utilizando un filtro de 5 micras Millipore estéril. Las suspensiones celulares deben ser filtrados con el fin de eliminar los agregados celulares, los huevos no digeridas y larvas eclosionadas. Filtrar 4-5 ml adicionales de frescas L-15 medios de comunicación a través del filtro para recuperar todas las células. No use fuerza excesiva durante la etapa de filtración para evitar damaging el filtro y / o las células. </li></ol> 4. El cultivo de células <ol><li> Sedimenten las células disociadas por centrifugación a 900 xg (~ 2500 rpm) durante 3 min (*). Usando una pipeta P1000 y puntas esterilizadas retire con cuidado todo el sobrenadante. Resuspender las células sedimentadas en completa medio L-15 y la placa 1 ml / pocillo. La cantidad del medio añadido depende del número de placas 8P utilizado, la confluencia de los gusanos en las placas, y el tipo de experimentos que se pueden realizar en las células. La densidad celular se puede determinar usando un hemocitómetro. Para patch-clamp grabaciones enchapado densidad de ~ 230.000 células / cm 2 es óptima. </li><li> Guarde la placa de 24 pozos en un recipiente Tupperware plástico con toallas de papel mojadas para evitar la evaporación del medio de cultivo. Almacenar el recipiente en un incubador humidificado a 20 ° C y el aire ambiente. </li><li> Las células suelen estar listos para los experimentos dentro de las 24 horas cuando la diferenciación morfológica y expresoion de los marcadores GFP están completos. Las células se pueden mantener en cultivo durante un máximo de 2 semanas, pero por lo general son más sanos hasta 7-9 días después de la siembra. El medio tiene que ser reemplazado una vez al día para mantener las células sanas. </li></ol>

C. elegans es un organismo modelo de gran alcance para descifrar los mecanismos genéticos implicados en el desarrollo, la conducta y el envejecimiento. Su conveniencia se debe principalmente a la facilidad con la que puede ser manipulada genéticamente y de su ciclo de vida corto. A pesar de su conveniencia, C. elegans tiene sus limitaciones. C. células elegans son pequeñas y confinado dentro de una cutícula a presión que limita la aplicación de métodos que requieren el acceso ...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un organismo modelo de gran alcance para la investigación de las bases moleculares de la función celular, la diferenciación y el comportamiento. Mientras que su genoma, metabólicos y las vías biosintéticas son similares a los vertebrados, su maleabilidad genética y molecular son mucho mayores 2. Entre sus ventajas son su tamaño y simple anatomía, su rápido ciclo de vida (3 días a 25 ° C), de corta duración de la vida (2 semanas) y gran número de crías (&gt; 200). Debido a su naturaleza hermafrodita y corto ciclo de vida, las manipulaciones genéticas y moleculares son sencillos en C. elegans, incluyendo la generación de animales transgénicos 3,4 y la aplicación de técnicas de saldo de genes tales como ARN de interferencia 5. C. cuerpo elegans y la cáscara de huevo son transparentes. Por lo tanto las células se pueden visualizar fácilmente tanto en el adulto y el embrión utilizando microscopía estándar. En los últimos 40 años, el C. elegans </em&gt; comunidad ha creado recursos invaluables para C. investigación elegans incluyendo una gran colección de mutantes, knockouts y transgénicos, una descripción detallada de la anatomía y desarrollo 6,7, incluida la reconstrucción completa del sistema nervioso 8, y un genoma secuenciado completamente, que es bien anotado y disponible para toda la comunidad ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). A pesar de las numerosas ventajas, algunos enfoques experimentales han sido difíciles en C. elegans. Estos incluyen los que requieren la accesibilidad a la membrana plasmática de las células y el aislamiento de los tejidos o tipos de células. De hecho C. tejidos elegans están confinados dentro de su esqueleto hidrostático a presión, que no es fácilmente digerido por tratamiento enzimático o detergentes. A finales de la década de 1990 Miriam Goodman y Janet Richmond pioneros métodos de registros electrofisiológicos de C. elegansneuronas y células musculares in situ 9,10. Si bien estos métodos nos dio pistas importantes sobre neuronal y la función muscular in vivo, que son desafiantes y bajo rendimiento. Los métodos alternativos para el estudio de la función de células in vivo se han desarrollado, sobre todo en especial en vivo de imágenes de calcio por medio de sensores de calcio genéticamente codificados como GCamP y cameleon 11-13. Estos métodos, sin embargo, no permiten el uso de herramientas farmacológicas porque se aplican en animales vivos intactos. El primer intento de cultivar C. elegans células in vitro en gran escala fue realizada por Laird Bloom durante la preparación de su tesis doctoral 14. Desafortunadamente, las dificultades encontradas con una pobre adhesión de las células al sustrato, pobre diferenciación celular y la supervivencia prevenir el establecimiento de este protocolo ya en un método de cultivo celular robusto. En 1995 Edgar y sus colegas publicaron un procedimientopara investigar la división celular y la morfogénesis por aislamiento y cultivo de una sola C. elegans embriones 15. Las células embrionarias obtenidos por la digestión de las cáscaras de huevo con una combinación de tratamiento enzimático y la disociación manual, continuaron proliferando, produciendo hasta ~ 500 células 15. Posteriormente, Leung y colaboradores cultivaron un pequeño número de blastómeras estudiar la morfogénesis intestinal. Ellos mostraron que uno in vitro aislados E blastómeros produjo células intestinales polarizadas que crearon una estructura análoga a la luz intestinal al interactuar entre sí a través de las salidas 16 adherentes apicales. Buechner y colegas también informaron un método similar para el cultivo C. elegans células embrionarias in vitro 17. Sobre la base de este trabajo inicial, Christensen y sus colegas desarrollaron un protocolo robusto para el cultivo embrionario C. elegans células in vitro 1. Ellosmostró que el aislado C. elegans células pueden diferenciarse en diversos tipos de células y mantener las características que poseen in vivo, incluyendo la expresión de marcadores específicos de célula. Varias técnicas que son un reto in vivo, se pueden aplicar en aislado C. elegans células embrionarias. Estos incluyen electrofisiológico 1,18 19, de formación de imágenes, y técnicas inmunoquímicas 20,21, así como el aislamiento de tipos de células específicas por-fluorescente clasificación de células activadas (FACS) para la construcción de bibliotecas de ADNc de células específicas de 22,23. Técnicas de genes desmontables tales como interferencia de ARN (RNAi) se pueden aplicar sobre culta C. elegans células 1 y un método novedoso marcaje metabólico usando Azido-azúcar como una herramienta para el descubrimiento de glicoproteína se ha desarrollado recientemente para cultivadas in vitro C. elegans células 24. En conclusión, el método de cultivo celular se expande la matriz Of técnicas que se pueden aplicar a la C. modelo elegans en un esfuerzo para descifrar la función de genes en el contexto de un organismo vivo. Se describe aquí el protocolo para el cultivo de C. Elegans células embrionarias in vitro, que se basa en gran parte en el protocolo descrito por primera vez por Christiansen y sus colegas 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans es un modelo de sistema de gran alcance, en la que las técnicas genéticas y moleculares son de fácil aplicación. Hasta hace poco, sin embargo, las técnicas que requieren acceso directo a las células y el aislamiento de determinados tipos de células, podrían no aplicarse en C. elegans. Esta limitación se debe al hecho de que los tejidos están confinados dentro de una cutícula presurizado que no es fácilmente digerido por el tratamiento con enzimas y / o detergentes. Basado en el trabajo de los pioneros por Laird Bloom, Christensen y sus colegas han desarrollado la 1 un método robusto para el cultivo de C. Elegans células embrionarias en gran escala. Los huevos están aisladas de adultos grávidas por tratamiento con lejía / NaOH y posteriormente tratados con quitinasa para eliminar las cáscaras de huevo. Las células embrionarias se disocia mediante pipeteo manual y sembraron en sustrato de vidrio cubierto en medio de suero enriquecido. Dentro de las 24 horas de las celdas de aislamiento comenzar a diferenciar cambiando la morfología y expresando marke células específicasrs. C. elegans células cultivadas con este método sobrevivir hasta 2 semanas in vitro y se han utilizado para electrofisiológico, inmunoquímica, y proyección de imagen analiza todo lo bien que se han clasificado y utilizado para los microarrays de perfiles.

C. elegans y células cultivadas se diferencian de células expresan marcadores específicos Christensen y sus colegas utilizando tinción con azul tripán demostraron que&gt; 99% de los embriones C. elegans células sobreviven el procedimiento de aislamiento. En días 9 y 22 después de la siembra, 85% y 65%, respectivamente, siguen vivos 1. Aislado embrionario C. células elegans deben adherirse a un sustrato con el fin de diferenciar. Las célul...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Se describe aquí un protocolo revisado para el cultivo a gran escala de embriones C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parecen diferenciarse y recapitular la expresión de genes de una manera específica de la célula. Las técnicas que requieren el acceso directo a las células o el aislamiento de tipos de células específicas de los otros tejidos se pueden aplicar sobre C. elegans células cultivadas.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.5K vistas.  University of Miami.  Se describe aquí un protocolo revisado para el cultivo a gran escala de embriones C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parecen diferenciarse y recapitular la expresión de genes de una manera específica de la célula. Las técnicas que requieren el acceso directo a las células o el aislamiento de tipos de células específicas de los otros tejidos se pueden aplicar sobre C. elega...

Video: A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Aplicación de un ensayo de C. elegans la degeneración neuronal de dopamina para la validación del potencial de la enfermedad de Parkinson genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Preparación Extienda los cromosomas de las células estaminales embrionarias para cariotipo

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Un método para cultivar embrionarias

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