El objetivo de este procedimiento es evaluar la organización y dinámica de los microtúbulos in vivo. Las neuronas son células polarizadas con distintos compartimentos axonales, dendríticos y sinápticos, mantenidos por su citoesqueleto subyacente. Los microtúbulos forman la mayoría del citoesqueleto neuronal, y la dinámica y la orientación determinan los eventos clave durante el desarrollo y la maduración neuronal.
Los microtúbulos están compuestos por heterodímeros de tubulina alfa y beta, y están inherentemente polarizados con extremos más altamente dinámicos y extremos negativos estables. Durante la polimerización en los extremos superiores, un complejo multimolecular de proteínas de unión al extremo, se asocia transitoriamente con los protofilamentos y promueve el ensamblaje de dímeros de tubulina. Esta técnica nos ayudará a visualizar microtúbulos neurales in vivo.
Usando esta técnica, se puede determinar la orientación y otros parámetros de los microtúbulos dinámicos durante el desarrollo y la regeneración de la neurona C.elegans. Por lo general, usamos este reportero para visualizar la dinámica de los microtúbulos en la neurona sensorial. Sin embargo, uno puede expresar este reportero en otros tipos de células, como los músculos y la piel, para visualizar microtúbulos dinámicos en estas células.
Las proteínas de unión al extremo etiquetadas fluorescentemente como EBP a GFP aquí, aparecen como cometas. La dinámica de estos cometas se ha correlacionado con el crecimiento concomitante de los microtúbulos, y un indicador clave para medir la dinámica y orientación de los microtúbulos. Para observar estos cometas en un tipo celular específico, los transgenes con ADN de EBP-2 y GFP se expresan bajo un promotor específico.
Para la expresión en las neuronas PLM, este transgén se expresa bajo la marca para promotor. Estos gusanos transgénicos se pueden ver bajo un microscopio estereoscópico, con fluorescencia configurada antes de clasificarlos o montarlos. Para montar los gusanos para obtener imágenes de cometas EBP, hacemos un 10% Argos en el búfer M9.
y coloque una gota en un portaobjetos de vidrio. Otra diapositiva se utiliza para presionar la gota en una película que se solidifica en una almohadilla. Utilizamos perlas de poliestireno de 0,1 micras como medio de montaje, se recogen algunos gusanos y se vuelven a suspender en la solución de perlas.
Se caza furtivamente un resbalón de cubierta para inmovilizar los gusanos y se toma para obtener imágenes. Los montados se pueden obtener imágenes en cualquier microscopio de fluorescencia con una cámara para imágenes de alta resolución. La configuración está equipada con una unidad de disco giratorio para una adquisición más rápida y un blanqueamiento fotográfico y una toxicidad fotográfico reducidos.
La diapositiva se mantiene en el escenario y el campo de gusanos se enfoca y centra utilizando la iluminación de campo brillante. Un objetivo de bajo aumento como 5X o 10X se puede utilizar para este propósito. Los gusanos se pueden volver a enfocar a un objetivo de gran aumento como 63X utilizando la misma iluminación.
Este objetivo proporciona una resolución espacial óptima para la obtención de imágenes de los cometas. Un centrado fijo de la neurona PLM se realiza bajo la iluminación de fluorescencia para evitar la exposición indebida a la luz y el fotonco blanqueamiento del suero. Para la adquisición de imágenes utilizamos software de envío fuera de los sitios.
Utilizando la configuración de imágenes en vivo en el canal de campo brillante, enfocamos la región de la cola del gusano y la centramos en el campo de visión. Esto es seguido por el enfoque de la neurona PNM utilizando la configuración de imágenes de luz con luz de excitación de 488 nanómetros. Para una adquisición de lapso de tiempo, se crea un entorno experimental donde el tiempo de exposición, la duración del lapso de tiempo y el intervalo entre los fotogramas definen las habilidades temporales de la imagen.
Para mediciones cuantitativas, algunas películas de cometas EBP se analizarán en la Imagen J, que es un software de código abierto. El lapso de tiempo adquirido se abre como una cadena de varias imágenes, que se puede previsualizar como una película. En este lapso de tiempo en particular, los cometas se pueden ver en el cuerpo celular, el proceso anterior y posterior de la neurona PLM.
Los cometas que se alejan del cuerpo celular se clasifican como más-extremo-out, y los que se mueven hacia el cuerpo celular se clasifican como menos-extremo-fuera. Para comenzar el análisis se dibuja una línea segmentada sobre la región de interés, que en este caso es el proceso interior de la neurona PLM. Este segmento de línea se convierte en un kymograph utilizando la función de reslice de imágenes.
Un kymograph es una imagen de distancia temporal con pliegues diagonales que representan los cometas en movimiento. Los segmentos de línea recta se pueden dibujar en estas trazas y los parámetros de medición se pueden establecer utilizando el menú de análisis. Estos parámetros se pueden convertir a cantidades y unidades medibles estándar en el programa de análisis de datos como Excel.
El ancho de la traza corresponde a la longitud de crecimiento. El hight representa la duración del crecimiento, y el ángulo del pliegue da la dirección de los cometas. Estos cometas se pueden clasificar en más-extremo-fuera y menos-extremo-fuera, para encontrar la orientación relativa de los microtúbulos.
La expresión transgénica de EBTA GFP se puede adaptar para observar la dinámica de los microtúbulos en diversos contextos celulares, como la nueva regeneración. Para observar la dinámica de los microtúbulos en los axones de clasificación de la región, el axón se lesiona utilizando un láser de femtosegundo, que puede corte el axón con precisión sin causar daños colaterales masivos. Después de la lesión, los gusanos se pueden recuperar en placas de motor secuestas para observaciones posteriores.
Las neuronas PLM muestran una regeneración exoneree robusta, que se puede observar tan pronto como seis horas después de la lesión. Para evitar la fototoxicidad para regenerar nuevos derechos, las imágenes en vivo se llevan a cabo en un microscopio de disco giratorio. Las adquisiciones de lapso de tiempo de los axones regeneradores se pueden convertir posteriormente en kymographs para el análisis de cometas.
La duración de la distancia y la dirección de los cometas se pueden interpretar en términos de orientación y dinámica de los microtúbulos. Mi orientación crítica y dinámica son determinantes clave de los procesos celulares civiles como la división celular, la migración y el mantenimiento de la arquitectura celular. Aunque hay muchas herramientas disponibles para la medición de la dinámica de microtúbulos, la medición in vivo puede ser un desafío.
La autoflorescencia, la fototoxicidad, el artefacto de sobreexpresión y las intensidades variables reportadas son algunas de las dificultades encontradas durante la observación en vivo de proteínas de unión al extremo, para evaluar la dinámica de los microtúbulos. Mediante el uso de un transgénico integrado con baja concentración de ADN deportado e imágenes de baja iluminación, este estudio ha abordado métodos para mitigar algunos de estos desafíos. Los módulos de imágenes y análisis descritos aquí se pueden extender hacia otros reporteros basados en microtúbulos y transporte de proteínas.
Esto no solo es aplicable a las neuronas C.elegance, sino que también se puede aplicar a otros tipos de células y sistemas modelo.
