Este protocolo permite a los investigadores cultivar colonias de células madre en hidrogeles con control total sobre la rigidez del hidrogel y la geometría de las colonias. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores cultivar colonias de células madre en condiciones que imitan mejor el entorno fisiológico que el plástico de cultivo de tejidos. Al realizar este protocolo por primera vez, asegúrese de generar algunos materiales adicionales y utilice un ligando fluorescente para que pueda solucionar problemas y optimizar en cada paso.
Esta técnica implica varios pasos que implican el posicionamiento preciso de diversos materiales. Es mucho más fácil entender las instrucciones escritas para este protocolo una vez que lo haya visto realizado. Para comenzar este procedimiento, mezcle la base de PDMS con el agente de curado PDMS en una relación de 10 a una por peso y mezcle bien.
Desgasar esta mezcla en un desecador durante 30 a 60 minutos o hasta que se retiren todas las burbujas de aire. Verter lenta y uniformemente la mezcla DE PDMS sobre la superficie de la oblea preparada. Toque el plato en la superficie de trabajo para liberar cualquier burbuja de aire de la superficie de la oblea.
Hornee el PDMS a 70 grados centígrados durante dos horas y deje que se enfríe a temperatura ambiente. A continuación, corte el PDMS en aproximadamente 10 por 10 milímetros cuadrados, cada uno de los que contiene las entidades para una sola condición experimental. Estos se denominarán sellos para el resto del protocolo.
Después de esto, mezcle la base de PDMS con el agente de curado PDMS en una proporción de ocho a uno por peso, y mezcle bien. Desgasar la mezcla en un desecador durante 30 a 60 minutos o hasta que se retiren todas las burbujas de aire. A continuación, verter lenta y uniformemente el PDMS en un plato limpio de 100 milímetros.
Toque el plato en la superficie de trabajo para liberar cualquier burbuja de aire. Hornee el PDMS a 70 grados centígrados durante dos horas y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Para cada sello generado previamente, corte un cuadrado de 15 por 15 milímetros de PDMS.
Estos se denominarán losas planas para el resto del protocolo. Invierta cada sello generado en una losa plana de PDMS de forma que las entidades del soporte estén en contacto con una losa plana de PDMS. Presione suavemente en la parte superior del sello con fórceps para asegurar un contacto uniforme.
A continuación, coloque una pequeña gota de polímero curable UV en la interfaz superior de cada par de sellos y losas. El polímero será perverso entre los dos por tensión superficial asistida por la gravedad. Coloque una pequeña gota del polímero curable UV alrededor de los bordes del sello y la interfaz de losa.
Esto crea un borde que mantendrá la solución de ligando. A continuación, coloque cuidadosamente el sello y los pares de bofetadas en una caja de esterilización UV. Utilice el ajuste de alimentación STR estéril y exponga durante 10 minutos.
Después de esto, retire los pares de la caja de esterilización UV y utilice dos pares de fórceps para quitar suavemente el sello mientras mantiene presionada la losa plana y la plantilla que se formó a partir del polímero curable UV. Con fórceps, retire cuidadosamente la plantilla e invierta de forma que la superficie que está en contacto con la losa plana de PDMS esté mirando hacia arriba. Vuelva a colocar las plantillas invertidas en la caja de esterilización UV.
Utilice el ajuste de alimentación STR estéril y exponga durante tres minutos. Usando fórceps, coloque cuidadosamente cada plantilla en el lado plano hacia abajo en un cubreobjetos lavado ácidos asegurándose de que las características estén centradas en el resbalón de la cubierta. Coloque una pequeña pieza de película de laboratorio encima de cada plantilla.
Presione firmemente y uniformemente hacia abajo en la plantilla para crear un fuerte contacto entre la plantilla y el cubreobjetos. Coloque los resbalones de la cubierta con plantillas en un plato. Coloque este plato en un limpiador de plasma y aplique plasma de alta potencia durante 30 segundos.
A continuación, pipetear la solución de ligando sobre la superficie de cada plantilla. Para plantillas hechas de sellos cuadrados de 10 por 10 milímetros, aplique 100 microlitros por plantilla. Después de esto, envuelva el plato que contiene los resbalones de la cubierta en la película de laboratorio y incubar a cuatro grados centígrados durante la noche.
Primero, lave el cubreobjetos con plantilla usando fórceps para sumergirlo brevemente en un plato que contenga PBS estéril. Sumerja el cubreobjetos con plantilla en una segunda etapa de PBS para lavarlo de nuevo. Retire la plantilla de la superficie del cubreobjetos teniendo cuidado de no romper el cubreobjetos.
A continuación, sumerja brevemente el cubreobjetos en un plato que contenga agua ultrapura para eliminar las sales de los lavados PBS. Toque el borde del cubreobjetos a una delicada limpieza de la tarea para eliminar el exceso de agua. Seque el resbalón de la cubierta bajo un gas inerte como el nitrógeno.
A continuación, prepare una solución de poliacrilamida para obtener la elasticidad de hidrogel deseada. Para cada cubreobjetos estampado, prepara un labio de las cubiertas inferiores activado por glutaraldehído con un espaciador colocado en la parte superior. Pipeta entre 75 y 150 microlitros de solución de poliacrilamida al centro de cada tapapso activado de glutaraldehído.
Usando fórceps, coloque un patrón para cubrir el deslizamiento en cada deslizamiento de glutaraldehído activado cubiertas resbaladizas con poliacrilamida y espaciador de tal manera que el ligando estampado se enfrente a la solución de poliacrilamida. Coloque cuidadosamente cada sándwich de poliacrilamida en un soporte de tapa con hilos compatibles con tubos inferiores cónicos de 15 mililitros. Atornille un tubo inferior cónico de 15 mililitros en cada soporte de la tapa para mantener los sándwiches de poliacrilamida en su lugar.
Centrifugar a sándwiches de poliacrilamida en los tubos en cubos oscilantes a 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire los tubos de la centrífuga y colóquelos en bastidores de tubos para mantener la orientación durante 50 minutos adicionales para garantizar la polimerización completa. Luego, retire los sándwiches de los tubos y sumérjalos en PBS.
Envuelva el plato en película de laboratorio e incubar a temperatura ambiente durante tres horas o a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de esto, utilice un bisturí y fórceps para eliminar cuidadosamente el patrón para cubrir los resbalones y el espaciador del sándwich de poliacrilamida mientras permanece sumergido en PBS. Coloque cada cubreobjetos con poliacrilamida estanada en un soporte de tapa.
Lugar de la junta en la parte superior del resbalón de la cubierta y alrededor de la poliacrilamida donde se encontraba el espaciador. Atornille un tubo inferior cónico de 15 milímetros aserrado en el soporte de la tapa, formando un pozo con la poliacrilamida estanada en la parte inferior. Estos conjuntos caben en los pozos de una placa de 12 pozos estándar para un fácil manejo.
Al realizar esta técnica, utilice un ligando fluorescente para asegurarse de que el patrón deseado se crea en la superficie del resbalón de la cubierta de vidrio, y se transfiere con éxito a la superficie del hidrogel de poliacrilamida durante la polimerización. La última medida del éxito para este método es la capacidad de cultivar hESC en geometrías deseadas en los hidrogeles estampados. Cuando se hace referencia a la referencia como se describe en el protocolo de texto, los hESC suelen proliferar para completar las geometrías con patrones de 48 a 72 horas una vez que el Y27632 se elimina por completo de los medios.
El cultivo de colonias de hESC en geometrías confinadas en hidrogeles de poliacrilamida permite la medición de las fuerzas de tracción generadas por células mediante microscopía de fuerza de tracción. Estas mediciones se realizan mediante la incrustación de microesferas de fluorescencia en el hidrogel y la toma de imágenes de las posiciones de estas cuentas antes y después de la siembra de hESC. Las imágenes de las posiciones del cordón se pueden utilizar para generar mapas de desplazamientos de cuentas que posteriormente se pueden utilizar para calcular las tensiones de tracción subyacentes.
En las colonias circulares de hESC, las tensiones de tracción más grandes se encuentran cerca del borde periférico de las colonias, mientras que el centro de las colonias muestran tensiones de tracción uniformemente bajas. A pesar de las distribuciones no uniformes observadas de tensiones de tracción, los hESC cultivados como círculos estampados en condiciones de mantenimiento, muestran la expresión uniforme del marcador de pluripotencia Oct 3/4 y la molécula de adhesión celular E-cadherina. Esta técnica permitirá a los investigadores modelar mejor los embriones humanos utilizando células madre embrionarias humanas, lo que en última instancia, conducirá a información importante sobre cómo se desarrollan los seres humanos.
Este procedimiento se puede adaptar para cualquier aplicación en la que un investigador tiene como objetivo cultivar células en geometrías definidas en hidrogeles blandos. Este procedimiento es compatible con la mayoría de los ácidos bioquímicos, lo que permite a los investigadores responder preguntas sobre cómo cosas como la geometría del tejido y las fuerzas generadas por células afectan la expresión de proteínas y la señalización celular. Muchos investigadores están utilizando células madre embrionarias humanas para modelar el desarrollo humano temprano.
Esta técnica permitirá a los investigadores responder a estas preguntas importantes en condiciones que imitan mejor un entorno fisiológico.
