Los autores desean agradecer a la Fundación Baker y &#39;Mujeres en la Ciencia de becas &quot;Fundación de la Real Niños apoyo de Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty y Edouard G. Stanley son NHMRC mayores becarios de investigación. El trabajo en sus laboratorios fue apoyado por NHMRC y Células Madre Australia.

Declaración de Ética: La aprobación ética para la recogida de tejidos de malformación y prepucio linfáticos se obtuvo de los Comités Éticos de Investigación Humanos del Hospital Royal Children de Melbourne, Australia. Firmado el consentimiento se recibió de los padres de los pacientes antes de la cirugía. Las muestras de tejido se obtuvieron de pacientes con diagnóstico de LM sometidos a procedimientos quirúrgicos como parte de su manejo clínico y los pacientes sometidos a la circuncisión electiva. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica, Australia. 1. Preparación de la suspensión de células de prepucio y Malformación linfática tejidos <ol><li> Los tampones y Preparación de Medios. <ol><li> Preparar completa de medios de células endoteliales utilizando comercialmente disponible EGM-2 Kit Bullet MV calentando EGM-2 medios y suavemente descongelar los componentes del kit de 37 ° C baño de agua. En cabina de bioseguridad de clase II, asépticamenteagregar cada componente para los EGM-2 medios de comunicación. Una vez que todos los componentes se añaden a los medios de comunicación, se refieren a este medio de comunicación como &quot;medio completo de las células endoteliales. Utilice estéril pipeta 50 ml para mezclar el contenido antes de su uso. NOTA: Todas las etapas relativas a cultivo celular se llevan a cabo en un gabinete de riesgo biológico de clase II. Todas las soluciones se almacenan a 4 ° C según las instrucciones del fabricante y se calientan a la temperatura ambiente antes de su uso. Los medios de comunicación completos de células endoteliales, tampones de cultivo celular y soluciones de enzima se calientan a 37 ° C durante 20 min antes de su uso. </li><li> Suplemento completo medios de comunicación de las células endoteliales con 50 ng ml VEGF-C /. Alícuota de los medios de comunicación de las células endoteliales complementado en tubos de 50 ml estériles y se almacena a 4 ° C hasta su uso. Los medios de comunicación es estable durante al menos 4 semanas cuando se almacena a 4 ° C. </li><li> Preparar el calcio y el magnesio libre de buffer fosfato salino (PBS) disolviendo 8,752 g de NaCl, 1,416 g de Na 2 HPO 4 .2H 2 O y0.395 g KH 2 PO 4 en 1000 ml de agua. Ajustar el pH a 7,4. Filtrar esterilizar PBS utilizando 0,22 micras filtro y se almacena a 4 ° C. Antes de su uso añadir solución de antibiótico / antimicótico (utilizado en 1: 100). </li><li> Para preparar la fibronectina humana, disolver 1 mg de fibronectina en 10 ml de agua estéril. Tienda reconstituyó solución en alícuotas de 100 mu l a -20 ° C. En el día de uso agregar 10 ml de PBS estéril para 100 l de alícuota fibronectina (para dar una concentración de trabajo final de 10 mg / ml). </li><li> Para los medios de enzimas, preparar una solución que contiene 0,04% dispasa II, 0,25% de colagenasa II y 0,01% de DNasa I en PBS estéril. En primer lugar, pesar dispasa y colagenasa, lugar en un tubo de 50 ml estéril, añadir el volumen requerido de PBS y se incuba durante 30 min con agitación a 37 ° C para disolver. Una vez disuelto, esterilizar filtro (0,22 micras filtro) solución dispasa / colagenasa en campana de bioseguridad. Añadir asépticamente la DNasa I. tienda la solución enzimática a 37 ° C hastausar. NOTA: DNasa I es un grado reactivo cultivo celular comercial disponible como polvo liofilizado estéril. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la suspensión de células de prepucio y del sistema linfático Malformaciones <ol><li> Pesar un tubo de 50 ml que contiene 10 ml de DMEM / 2% de solución antimicótica antibiótica. Este tubo será utilizado para la recogida de tejidos. </li><li> Después de la eliminación quirúrgica de malformación linfática y tejidos de prepucio, añadir asépticamente muestra de tejido al tubo y la transferencia en hielo al laboratorio de cultivo celular. </li><li> Pesar el tubo que contiene el tejido y calcular el peso del tejido. Utilice este peso para calcular el volumen de solución enzimática necesaria para digerir el tejido. </li><li> En un gabinete de bioseguridad Clase II, utilice pinzas estériles para transferir el tejido y los medios de comunicación en una placa de 100 mm de cultivo de tejidos. Con unas tijeras estériles para picar finamente el tejido en ~ 1 mm 3 piezas. </li><li> Transferencia de tejido picado mezclado con i mediosnto un tubo de 50 ml que contiene un adicional de 10 ml de 2% de solución antimicótica estéril DMEM / antibiótico. Mezclar por inversión para volver a suspender el tejido. Centrifugar la muestra a 300 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Basado en el peso de tejido, añadir 1 ml de pre-calentado (37 ° C) de colagenasa II solución de digestión / DNasa I / dispasa II por 100 mg de tejido picado. Generalmente, utilizar 10 ml de solución de enzima durante aproximadamente 1 g de tejido picado. </li><li> Incubar el tejido en un 37 ° C incubadora durante 20-90 min con agitación constante a 200 rpm. Al final de este período, asegúrese de que casi todo el tejido se digiere en fragmentos finos. NOTA: La exposición de las células a la colagenasa y dispasa en el momento de aislamiento de los tejidos influencias primaria supervivencia celular. Hemos encontrado empíricamente que la mayoría de las muestras de prepucio neonatal óptima requieren 20 a 30 min de la digestión, mientras que las muestras de malformaciones linfáticas fibróticas pueden requerir 60-90 minutos de la digestión. Rendimiento LEC LMs están influenciados por la cantidad de fibrosis presente, más tejido fibroso dando menos células, posiblemente debido a los efectos nocivos de la exposición prolongada a la colagenasa II y dispasa II. </li><li> Después de la digestión, transferir el tubo a la cabina de bioseguridad y pasar la solución tejido digerido a través de un filtro de 70 micras colocado en un tubo de 50 ml estéril. El uso de 3 ml émbolo de la jeringa con el émbolo de goma, moler abajo el tejido restante hasta que se observaron sólo pequeñas trazas de la matriz extracelular. </li><li> Lavar el filtro de células con un volumen equivalente de medio de células endoteliales con el volumen de disociar medio enzima para recuperar las células pegadas a tamiz y para inactivar las enzimas. Por ejemplo, para 2 ml de medio de disociación de la enzima para digerir el tejido picado, añadir 2 ml de medio de células endoteliales para inactivar las enzimas. </li><li> Centrifugar la solución de células a 300 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. R&gt; e-suspender las células en 10 ml de PBS. Centrifugar las células a 300 xgdurante 5 minutos, retirar el sobrenadante después repita lavado de células dos veces. &gt; Resuspender el sedimento celular en 20 ml de medio de células endoteliales. Contar las células usando azul de tripano después de semilla de 2 x 10&gt; 6 células en 150 cm&gt; 2 matraz de pre-recubiertas con fibronectina en un volumen final de 20 ml de medio de células endoteliales. Cultura a 37 ° C en un 5% de CO&gt; 2 en incubadora de aire humidificado.&gt; NOTA: Se espera que el 75% -90% de las células nucleadas sobrevivir la digestión del tejido estimada por exclusión de azul tripán. El recuento de células inicial refleja células nucleadas todo en la suspensión celular (es decir, queratinocitos, leucocitos, macrófagos, células del tejido conectivo y células de los vasos sanguíneos). El recuento de células en 5-7 días refleja células que se han adherido, sobrevivido y proliferado durante el cultivo celular. Recubrimiento frascos de cultivo de tejidos con fibronectina también mejora posterior LEC y la supervivencia LM LEC. </li><li> Después de la incubación durante la noche, lavar las células de distancia no unidos en tres lavados con PBS solución antibiótico-antimicótico / 1% y añadir medio fresco de células endoteliales. Llevar a cabo tres lavados para eliminar eficazmente las células no unidas y células rojas de la sangre presentes en el matraz. Cambie medios cada dos días. Las células serán ~ 80% confluentes después de 5-7 días. </li></ol> 3. Anticuerpo La tinción de células endoteliales para Linfático marcadores de superficie celular para Citometría de Flujo <ol><li> Después de que las células han alcanzado el 80% de confluencia, el medio aspirado y las células de enjuague con PBS. </li><li> Separar las células adherentes mediante la incubación de las células con 7 ml de solución de desprendimiento celular tal como Accutase por 150 cm 2 matraz durante 5-7 min a 37 ° C. </li><li> Células de la cosecha individual, inactivar la solución de desprendimiento de las células mediante la adición de 3 volúmenes de medio de células endoteliales y transferir la suspensión celular a un nuevo tubo estéril. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 5 ml de PBS. Células centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, retire el supernatant luego repetir lavado celular. Volver a suspender las células en 5 ml de PBS. </li><li> Contar el número de células viables. Mezclar 10 l de suspensión celular con 90 l de 0,4% de azul de tripano. Transferencia de 10 l de esta suspensión a hemocitómetro para recuento. NOTA: El rendimiento celular final dependerá del tamaño de la muestra procesada. El rendimiento celular usual por rangos de 150 cm 2 matraz de 7 x 10 5 a 1,2 x 10 6 de células viables. </li><li> Preparar las soluciones de anticuerpos para tinción celular. NOTA: Las siguientes diluciones se titularon para la tinción de 1 x 10 6 en un volumen de tinción de 100 l. <ol><li> Diluir PE ratón conjugado anti humana VEGFR-3 (1:50); Ratón conjugado anti CD34 PE-Cy7 humana conjugado (1: 200); Ratón CD31 APC-conjugado anti humana (1: 100) y Alexa 488 rata conjugado anti-humano podoplanin (1: 200) en el volumen total de 100 l estéril 5% de FBS / solución de PBS por muestra de tejido. Después de la preparación desolución de anticuerpos, mantener en hielo hasta su uso. Del mismo modo preparar mezcla de anticuerpos de control de isotipo diluido para facilitar la configuración de la citometría de flujo puertas. </li></ol></li><li> Para reducir la unión no específica de los anticuerpos, las células de centrifugación a 300 xg durante 2 minutos, retire sobrenadante entonces suspender las células en 100 l estéril 5% de SFB / solución de PBS por muestra para ser manchado. Se incuban las células en hielo durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Células centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, retire sobrenadante entonces las células en el cóctel de anticuerpos conjugados volver a suspender. También manchar una alícuota pequeña de las células (1 x 10 5) en 100 l mezcla de anticuerpo de control de isotipo. Se incuban las células en hielo durante 20 min. </li><li> Para eliminar el anticuerpo no unido, añadir 2 ml de solución de 2% de FBS / PBS y centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado. </li><li> Resuspender el sedimento celular para el control de isotipo y la muestra de anticuerpo manchado sean ordenados de 300 l de 0,5 mg / ml de propidio iodide / solución de FBS / PBS 2%. Colocar tubos en hielo hasta la clasificación. </li></ol> 4. Cell Sorting <ol><li> Utilice los materiales siguientes para configurar el instrumento; perlas de alineación tales como partículas fluorescentes disponibles comercialmente, solución salina basado fluido de funda tamponada con fosfato y el retardo de caída de perlas, tales como perlas fluorescentes Accudrop. </li><li> Aislar los LEC humanos purificados en un instrumento de clasificación de células activadas por fluorescencia de múltiples parámetros. Coloque el instrumento y alinear según las recomendaciones del fabricante. Además, ejecutar los controles de compensación mancha individuales con cada especie para generar la matriz de compensación y de purga para eliminar de este modo sustancial a través de la emisión de los fluorocromos tales como PE en el canal de PE-Cy. NOTA: Una mayor proporción de los FACS células clasificadas sobrevivir al aislamiento si una boquilla de 100 micras se utiliza y las células están ordenadas en el medio de las células endoteliales. </li></ol> 5. Cultivo Celular Publicar FACS Ordenaring <ol><li> Después de clasificación, centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5-10 ml de medio (dependiendo del matraz utilizado para sembrar la célula). Si están ordenadas de menos de 50.000 células, las células se cultivan en recubiertos de fibronectina 25 cm 2 matraz. </li><li> De lo contrario, cultivar las células en 75 cm 2 frasco de fibronectina recubierto a 37 ° C en un 5% de CO 2, aire humidificado incubadora. Cambie los medios después de 2 días. NOTA: los medios de comunicación de la célula se cambia cada segundo día porque prolongar el tiempo entre los cambios de los medios de comunicación parece favorecer la supervivencia de las células no endoteliales. Validamos el fenotipo de la célula endotelial linfática usando la detección inmunohistoquímica de marcadores: PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 y CD31 cuando las células son primero dividida para una mayor expansión 15. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

LEC juegan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de fluidos, la respuesta inmune a los antígenos extraños y la absorción y el transporte de algunos nutrientes. Homeostasis LEC puede verse afectada por los procesos de enfermedad, tales como infecciones bacterianas y la metástasis del tumor, pero los LEC también se puede desarrollar mutaciones somáticas que resultan en la formación de vasos linfáticos disfuncionales y morbilidad significativa para los pacientes afectados. Para obtener una mayor...

Una función importante del sistema linfático vascular es la de absorber la linfa, un fluido intersticial que contiene el exceso de lípidos, proteínas y componentes celulares, y llevar a cabo al sistema venoso de la sangre. Una red de capilares linfáticos dirige la linfa a los ganglios linfáticos en el que se analiza para detectar la presencia de antígenos extraños, un proceso importante en la vigilancia y el despliegue de las células blancas de la sangre para neutralizar antígenos extraños inmunológico. El sistema linfático unidireccional comienza en los tejidos con el capilar linfático inicial, una estructura única con una sola capa discontinua de células endoteliales planas de pared delgada con uniones de las células especializadas que permiten la entrada de la linfa 1,2. Estos capilares están unidos a la matriz de tejido conectivo vecina a través de anclaje filamentos para evitar el colapso recipiente en presencia de aumento de la presión intersticial 3. Los capilares linfáticos iniciales vacíos en la recogida de los capilares linfáticosque se unen en los vasos linfáticos o venas más grandes. En comparación con sus iniciales en vasos capilares linfáticos, la recogida de vasos linfáticos tienen más gruesas paredes de los vasos linfáticos, válvulas emparejadas y están encerradas por una membrana basal discontinua en la que unas pocas células musculares lisas se incrustan 4. Coordinado apertura y cierre de las válvulas linfáticos y la contracción de las células musculares lisas facilita el flujo de la linfa 3. En los seres humanos, las venas linfáticos de varias regiones del cuerpo se unen para formar troncos linfáticos que se fusionan para formar dos conductos linfáticos: conducto torácico y el conducto linfático derecho. El conducto torácico drena linfa desde el lado izquierdo del cuerpo y desde el lado derecho debajo del pecho mientras que la derecha linfático drena conducto linfático desde el brazo derecho y el lado derecho de la cabeza, el cuello y el tórax. Ambos conductos conducen la linfa en las venas subclavia en el cuello 5. Trastornos del sistema linfático se agruparse en una adquiridand congénita (Tabla 1). Ejemplos de condiciones adquiridas son linfangitis y linfedema secundario. La linfangitis es una inflamación de un vaso linfático debido a la infección bacteriana. Los linfáticos afectados se dilatan y se llenan de exudado que contiene células polimorfonucleares. En la piel, estos vasos linfáticos son visibles como rayas rojo subcutánea, dolorosa a menudo acompañada por la ampliación del nodo asociado drenaje linfático (linfadenitis) 6. El linfedema secundario surge como consecuencia de daños o obstrucción al recipiente o de los ganglios linfáticos obstrucción linfática. Esto conduce a la inflamación crónica progresiva debido a la acumulación de linfa distal al daño u obstrucción. En los países desarrollados, el linfedema secundario es más comúnmente asociado con la malignidad en tumores metástasis obstruyen los vasos linfáticos o ganglios linfáticos regionales, o como consecuencia de la terapia contra el cáncer después de la extirpación quirúrgica de los ganglios linfáticos, la fibrosis después de la irradiación y Throm post-inflamatoriaBosis y cicatrización 7. En otras partes del mundo, el linfedema secundario puede ser secundaria a obstrucción linfática causada por gusanos parásitos tales como Wuchereria bancrofti 6. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="4"> Trastornos del sistema linfático vascular </td></tr><tr><td> Adquirido </td><td colspan="3"> Congénito </td></tr><tr><td rowspan="3"> La linfadenitis El linfedema secundario </td><td> Primaria linfedema 10 </td><td> Esporádicos malformaciones linfáticas 13 </td><td> Linfático malformaciones asociadas con síndromes 13 </td></tr><tr><td rowspan="2"> por ejemplo, Síndrome de Milroy Síndrome de Meige </td><td> Sencillo: Malformaciones linfáticas </td><td rowspan="2"> por ejemplo, Síndrome de Klippel-Tranaunay Weber Parques Síndrome de Sturge-Weber </td></tr><tr><td> Combinado: Malformaciones capilares linfáticos Malformación capilar-linfático-venosa Malformación capilar-linfático-arteriovenosa Malformación venosa-arteriovenosa-capilar linfático </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Descripción general de los trastornos del sistema vascular linfático. Trastornos congénitos del sistema linfático incluyen el linfedema primaria (idiopática) pensado para ser causada por mutaciones genéticas, linfangiectasia y anomalías del sistema linfático 8,9. El linfedema primario puede ser esporádica, presumiblemente causada por mutaciones de novo o heredada. Trastornos linfáticos también pueden ser aislados o comprender parte de un síndrome más generalizada 10. En la población pediátrica, el 97% de la linfaEl edema es esporádico con anormalidades en la estructura de los vasos linfáticos que deterioran el drenaje linfático regional 11. Enfermedad de Milroy es un ejemplo de linfedema primario causado por una mutación en el gen evidente al nacer o poco después del 12 de VEGFR-3. Aunque la mayoría de condición familiar, la enfermedad de Milroy también se puede identificar en los lactantes sin antecedentes familiares de la enfermedad de Milroy 32. La gravedad de cualquier linfedema es dependiente de la cantidad de producción de linfa y la capacidad de transporte linfático de nuevo a la circulación venosa 6. Basado en la presentación clínica y en la proliferación de células endoteliales in situ, anomalías del sistema linfático se clasifican como tumores linfáticos o malformaciones linfáticas 13. Kaposiforme linfangiomatosis es un ejemplo de un tumor LEC 14. Malformaciones linfáticas se cree que surgen durante el desarrollo embrionario y crecer en proporción con el niño 15,16. Ellos rara vez regresan, pero pueden REMAIn asintomática hasta un trauma o infección precipitados rápido crecimiento que conduce a complicaciones clínicas. La estructura ordenada de la red linfática y la conducción de la linfa de los tejidos a la circulación venosa descrito anteriormente es perturbado en malformaciones linfáticas que consisten en colecciones localizadas de estructuras quísticas anormales llenos de líquido linfático. Si bien no hay evidencia clínica o experimental que estos vasos quísticas están conectados a la circulación linfática o que contienen válvulas linfáticos funcionales, su identidad linfático se confirma por la expresión de gama de marcadores de células linfáticas, tales como podoplanin, CD31, linfático Embarcación endotelial Receptor 1 (LYVE-1), proteína homeobox Prospero 1 (PROX-1) y VEGFR-3 15,17,18. Estas estructuras quísticas pueden ser pequeña (microquística) o grandes (macroquístico), pero la mayoría de las malformaciones linfáticas contener tanto microquística y componentes macroquísticas (Figura 1) 16. Después de la cirugía, injection escleroterapia y / o Ablación por Radiofrecuencia las malformaciones linfáticas menudo reaparecen. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Morfología de los vasos linfáticos humanos y malformaciones linfáticas. Linfático humano normal (A) y los vasos linfáticos malformación (B y C) marcadas con anticuerpo para podoplanin (etiqueta marrón, flecha). Vasos malformación linfática Humanos se caracterizan por la dilatación marcada y una considerable variación en el tamaño del lumen. Estas estructuras quísticas anormales localizadas pueden ser pequeña (microquística, *) (B) o grandes (macroquístico, #) (C). La mayoría de las malformaciones linfáticas contienen componentes microquísticas y macroquísticas. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.</a> &lt;/ P&gt; Algunos investigadores han sugerido que las malformaciones linfáticas representan un trastorno del desarrollo de la vasculatura linfática en el que los LECs no tienen potencial de crecimiento anormal, pero han fracasado en lugar de conectarse a la circulación normal 19. Sin embargo, hemos encontrado que los LECs LM proliferan más rápido y son más resistentes a la apoptosis de prepucio LEC 15 que sugiere que hay un defecto primario en el LM LEC. Cuando LM LEC se implantan en un modelo de xenoinjerto de ratón, forman estructuras que recuerdan a las malformaciones linfáticas 15. Esto apoya la hipótesis de que las malformaciones linfáticas pueden ser causados ​​por una o más mutaciones somáticas que surgen en LM LEC durante el desarrollo fetal. En efecto, informes recientes han identificado uno de tales mutación en la subunidad catalítica p110α de fosfoinositida-3-quinasa (PIK3CA) gene 20. Teniendo en cuenta los avances en la tecnología de secuenciación de ADN, mutaciones pertinentes could ser identificados más fácilmente en aislados LM LEC, guiando los estudios futuros de estas condiciones. El aislamiento de los LEC viables facilitaría las comparaciones entre los LEC anormales y normales en ensayos tales como la migración, la proliferación, la capacidad de formación de tubo y la supervivencia en respuesta a la disponibilidad de nutrientes reducida o agentes pro-apoptóticos 15. LEC aislados nos permitirían además de realizar la expresión génica de células específicas y estudios proteómicos, para delinear nuevas subpoblaciones LEC y descubrir nuevos agentes farmacológicos adecuados para el manejo clínico de las malformaciones linfáticas. Hemos publicado previamente un método de aislamiento LEC basada en la separación de cuentas magnéticas de LEC de prepucio neonatal y malformaciones linfáticas 15. Hemos informado una estrategia de separar los LEC normales y enfermos de las células endoteliales vasculares en base a la ausencia de expresión de CD34, seguido de someter la fracción de células CD34 Neg a la selección positiva para CD31.Sin embargo, este método se ve obstaculizada por la presencia de células no endoteliales residuales. Esto era independiente de la eliminación de la epidermis antes de la posterior digestión del tejido conectivo. Estos contaminantes generalmente proliferan más rápidamente y por lo tanto el tiempo overgrew los cultivos de células endoteliales a pesar de los intentos posteriores para repetir el aislamiento LEC. De hecho, una contaminación inicial de células no endoteliales tan bajas como 2% a 5% era suficiente para saturar la población LEC 15. Esto nos llevó a explorar método de clasificación de células con fluorescencia activado como una opción para mejorar el rendimiento de células LEC y pureza. Además, se utilizó multi-parámetro de clasificación para mejorar la especificidad de las poblaciones de LEC, añadiendo VEGFR-3 y podoplanin a los marcadores de selección para identificar CD34 CD31 Low Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin LEC. La razón para la selección de estos marcadores se basa en los informes que mientras ce LEC y vascular endotelial sangreLLS tener muchos marcadores de superficie celular en común, tales como CD31, LEC mostrar la variación fenotípica en su expresión de CD34, podoplanin y VEGFR-3 marcador de superficie celular en comparación con las células endoteliales vasculares sanguíneos 21-23. CD31 es una glicoproteína transmembrana de 130 kDa también conocido como plaquetas molécula de adhesión celular endotelial 1 (PECAM-1). Se considera que es un marcador de células pan-endotelial, ya que se expresa en todos los tipos de vasos sanguíneos y linfáticos 21,24,25. CD34 es 110-kDa glicoproteína transmembrana presente en más progenitor hematopoyético y las células, las células endoteliales vasculares y algunos vasos linfáticos 26 del vástago. VEGFR-3, el receptor para el crecimiento endotelial vascular factores de C y D, está presente inicialmente en las venas en desarrollo en el embrión de ratón, pero siguiente especificación linfático regulado por los factores de transcripción de la HMG-box relacionados con SRY (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f actor de 2 (COUPTF-II) y PROX-1, VEGFR-3 de expresión venosa se ​​pierde y se restringe a embrionaria LEC 25,27. Podoplanin, una membrana 38 kDa mucoproteína, se observó por primera vez en los vasos linfáticos en aproximadamente embrionarias día 11 (~ E11.0) del desarrollo embrionario del ratón 28 y mientras que se expresa fuertemente por los vasos linfáticos microvasculares, podoplanin expresión por endotelio linfático macroquístico en malformaciones linfáticas es más variable 15. La citometría de flujo experimentos sugieren que al menos algunas células endoteliales CD34 CD31 de alta Pos expresan el marcador linfático podoplanin 29. Aunque la evaluación sistemática de tinción LYVE-1 y podoplanin en malformaciones linfáticas humanos mostró que ambos son eficaces en la tinción del endotelio linfático malformación 30, en tejidos normales, se informó LYVE-1 para ser fuertemente presente en el linfático inicialendotelio capilar pero redujo e incluso ausente en el endotelio linfático recolectar 31. Como nuestro objetivo es aislar tanto las células endoteliales linfáticas iniciales y de recogida que hemos optado por no utilizar LYVE-1 como parte de nuestra estrategia de selección de celda. Finalmente, la decisión de emplear estos marcadores también se basa en la disponibilidad de anticuerpos que se utilizan para el diagnóstico para el etiquetado de los vasos linfáticos para imágenes microscópicas, una característica que permita correlación entre la citometría de flujo y estudios de inmunofluorescencia. En este artículo se describirá el método de digestión de tejido, tinción de células y la configuración de FACS requerido para el aislamiento con éxito de CD34 CD31 Low Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin LEC así como las células endoteliales CD34 CD31 de alta Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin de prepucio y malformación linfática tejido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Used to collect tissue samples from the operating theatre.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2179-VC-025</td>
			<td>Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>StemPro&#174;Accutase&#174; is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue dye</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Used as a viability stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Used at 0.04%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington Lab</td>
			<td>4176</td>
			<td>Used at 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Used at 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm nylon cell strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>356204</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343516</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303116,</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>337006</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400126</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400120</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400525</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting

Trastornos del sistema linfático, como el linfedema primario, malformaciones linfáticas y los tumores linfáticos son raras condiciones que causan morbilidad significativa pero poco se sabe sobre su biología. Aislamiento de células altamente puros humanos linfáticas endoteliales (LEC) de tejido enfermo y sano facilitaría estudios del endotelio linfático en los niveles genéticos, moleculares y celulares. Se prevé que estas investigaciones pueden revelar objetivos para nuevas terapias que pueden cambiar el manejo clínico de estas condiciones. Se presenta un protocolo que describe el aislamiento de prepucio humano LEC y las células endoteliales linfáticas malformación linfática (LM LECs). Para obtener una única suspensión de células de tejido se picó y se trató enzimáticamente usando dispasa II y colagenasa II. La suspensión de células única resultante se marcó con anticuerpos frente a grupo de diferenciación (CD) marcadores CD34, CD31, Vascular Endotelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) y podoplanin. STAIcélulas viables NED fueron ordenados en un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) para separar la población CD34 CD31 Low Pos VEGFR-3 Pos Pos podoplanin LM LEC de otras células no endoteliales endotelial y. Los LEC LM según se cultivaron y expandieron en frascos de fibronectina recubierto para uso experimental.

Después de la digestión inicial del tejido, después de 24 horas en cultivo de muestras no fraccionadas, las colonias de células endoteliales se pueden observar distintas (Figura 2A) junto con células similares a fibroblastos y células musculares lisas. Después de la clasificación y después de 24 horas en cultivo celular, las células CD34 CD31 Low Pos VEGFR-3 células Pos Pos Podoplanin adjuntar y mostrar la morfología de adoquín típica (Figura 2B y <st...

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Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

El objetivo de este protocolo es aislar las células endoteliales que recubren linfáticos malformación linfática buques y prepucios humanos como quistes utilizando células activadas por fluorescencia (FACS). Cultivo celular posterior y la expansión de estas células permite un nuevo nivel de sofisticación experimental para estudios genéticos, proteómicos, funcionales y diferenciación celular.

Aislamiento de células endoteliales linfático humano por Multi-parámetro de clasificación de células activadas por fluorescencia

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

14.2K vistas.  The Royal Children&#146;s Hospital.  El objetivo de este protocolo es aislar las células endoteliales que recubren linfáticos malformación linfática buques y prepucios humanos como quistes utilizando células activadas por fluorescencia (FACS). Cultivo celular posterior y la expansión de estas células permite un nuevo nivel de sofisticación experimental para estudios genéticos, proteómicos, funcionales y diferenciación celular. 

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A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

A tiempo real Técnica de Impedancia Eléctrica base para medir la invasión de monocapa de células endoteliales de las células cancerosas

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Investigación

Medicina

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

La muerte celular asociada con Mitosis anormal observada por Imagen confocal en vivo las células cancerosas

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

El aislamiento, la cultura, y de imágenes de Human Fetal pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias de las arterias y venas caninas

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

Aislamiento de células progenitoras endoteliales de voluntarios sanos y su potencial migratorio influenciado por las muestras de suero después de cirugía cardiaca

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Preparación y<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterización de Magnetized miR-modificado células endoteliales

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.