Desarrollamos un método innovador para la metabolómica. Combinamos la imagen espectral de Belfry de células vivas con espectrometría de masas de una sola célula. Nuestra técnica puede monitorear y predecir los cambios metabólicos de las células individuales contra los medicamentos.
Y esto abre una gran cantidad de aplicaciones para la investigación básica y la industria. Nuestro método añade resolución de una sola célula a las técnicas actuales de evaluación de fármacos que ayudarán en gran medida a futuros esfuerzos de descubrimiento de fármacos. Nuestra técnica también puede ayudarnos a entender el papel desempeñado por la heterogeneidad celular en la resistencia al cáncer.
El muestreo de una sola célula y el análisis de datos son los aspectos más desafiantes de este experimento. Actualmente estamos trabajando en la automatización de estos dos pasos, especialmente la parte de muestreo. Le recomendamos que practique el muestreo de una sola celda mucho antes del experimento, ya que cada configuración del micromaniprógrafo es ligeramente diferente y debe tomarse el tiempo para familiarizarse con los controles.
Después de incubar las células para llegar al 70%confluencia, células de cultivo de interés en un medio de cultivo apropiado, añadir Penicilina-Estreptomicina para evitar la contaminación. Después de medir la densidad celular en un hemocitoómetro, las células de subcultura se convierten en una placa de rejilla inferior de vidrio de 35 milímetros o diapositivas de cuarzo, utilizando el mismo medio con una densidad de siembra de 0,7 veces 10 a la sexta. Luego incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas.
Al día siguiente, las células alcanzan una confluencia de 50 a 60%Lave las células dos veces con búfer PBS precalegado a 37 grados centígrados. Divida las células en subgrupos tratados con medicamentos y no tratados en platos de cultivo de 35 milímetros. Mezclar tamoxifeno disuelto en dimetil sulfóxido con los medios de cultivo para obtener un volumen final de dos mililitros y concentración de tamoxifeno de 10 micromolares.
Este es el grupo tratado con drogas. Mezclar un volumen correspondiente de DMSO en el medio como un grupo de control para estudiar los efectos de DMSO. Incubar ambos grupos en dos mililitros de los medios con púas durante 24 horas para alcanzar una confluencia de 70 a 80% Antes de las mediciones espectrales, verificar la coincidencia de agujero y posición láser usando un objetivo.
Para calibrar el espectrofotómetro antes de cada experimento, coloque el etanol en un plato de fondo de vidrio, mida el espectro a una intensidad láser dada durante un segundo y asocie el pico a longitudes de onda conocidas. A continuación, configure la microcámara en 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. Una vez que el sistema de microscopio esté listo, retire las células de la incubadora y enjuague inmediatamente las células dos veces con tampón PBS calentado a 37 grados centígrados.
A continuación, agregue dos mililitros de PBS calentado o FluoroBrite DMEM. Agregue 10 microlitros de agua a la lente objetivo de inmersión en agua. Y coloque delicadamente la placa de células inferiores de vidrio en la etapa del microscopio.
Fije el sistema de muestreo celular en el microscopio Raman. Conecte el micromaniprógrafo 3D al soporte capilar de vidrio que está unido a una jeringa vacía para succionar la muestra. Ajuste el microscopio a un campo de alto aumento de 40 veces para observar la punta del capilar de vidrio, y asegúrese de que no esté roto.
Controle la posición del capilar de vidrio utilizando el micromaniprógrafo. Asegúrese de que la punta capilar esté centrada en el campo de visión. A continuación, mueva el capilar hacia arriba en el eje Z para dar espacio para el plato de cultivo más tarde.
Coloque el plato de muestra en el escenario del microscopio, ajuste el aumento y el enfoque, seleccione la celda de destino en la placa de cuadrícula y muévala al centro de la vista. Mida cada célula enfocando la línea láser. Un tiempo de exposición de 15 segundos por célula es suficiente para obtener una sección transversal de una célula con una señal Raman clara.
Un galvano-espejo permite escanear una célula o un grupo de células en varias docenas de minutos. A continuación, baje cuidadosamente el capilar de vidrio utilizando micromanipulador hasta que la punta se enfoque. Bajo observación microscópica, toque la célula única objetivo con la punta capilar.
A continuación, comience a aplicar presión negativa con la jeringa para atrapar la célula dentro de la punta capilar. Grabe este procedimiento tomando un video para comprobar el tiempo y la ubicación chupada de la celda con precisión. Mueva el capilar hacia arriba en el eje Z.
A continuación, desprenda el capilar del soporte capilar utilizando fórceps en preparación para el análisis de espectrometría de masas. Después de configurar el instrumento de espectrometría de masas y analizar los medios, agregue dos microlitros del disolvente de ionización al capilar que contiene la célula. Fije el capilar a un adaptador nano-electrospray conectado a un espectrómetro de masas adecuado e inicie el método de adquisición automática.
Aquí se muestra un análisis comparativo del espectro medio de cada afección, con y sin tratamiento farmacológico. El espectro medio de las dos condiciones difiere claramente en varios picos. En particular, los picos en 1.000 por centímetro, que es un signo de compuestos aromáticos como la fenilalanina y la tirosina, muestran fuertes diferencias.
Sobre la base de la proyección sobre el modelo de estructura latente, se calcularon las puntuaciones VIP que representan la importancia de las longitudes de onda en la discriminación de las condiciones experimentales. Es importante destacar que los picos más altos de los perfiles VIP correspondían a picos De Raman para los que se observaron fuertes diferencias entre los dos tratamientos. Esto confirmó las diferencias moleculares específicas entre las células tratadas y las no tratadas.
Después de la identificación positiva, la abundancia relativa de la droga y sus metabolitos se midieron en cada célula y se compararon con los picos de fondo en las células no tratadas. Se observó una fuerte variación en la abundancia de tamoxifeno. Y este fenómeno fue aún más pronunciado en el caso de su metabolito 4-hidroxi-tamoxifeno.
Los investigadores pueden estar interesados en explorar el vínculo entre las imágenes espectrales y los perfiles metabólicos de las células. Nuestra investigación también tiene aplicaciones industriales porque permite el cribado local de células para la fabricación farmacéutica. Se debe tener cuidado al preparar el disolvente de ionización para las mediciones del espectrómetro de masas.
Debe prepararse bajo una campana de humos. Además, tenga cuidado de no tocar la fuente iónica del instrumento del espectrómetro de masas para evitar ser electrocutado. Finalmente, los capilares de muestreo utilizados a lo largo de la medición son muy afilados, así que manéjelos con cuidado para evitar lesiones.
