Hay un alto número de productos químicos de la EDC en nuestro medio ambiente, principalmente sustancias estrogénicas. La diversidad química de las sustancias pertenecientes al grupo dificulta su ensayo, ya que se requieren diferentes métodos para su detección. Basado en la estructura química, es realmente difícil determinar si una sustancia es realmente capaz de trabajar como un estrógeno.
Además, estas sustancias nunca están presentes en una forma pura en el medio ambiente, por lo que sus efectos pueden ser influenciados por otros compuestos, también. Este problema se resuelve mediante métodos dialectistas de efecto como el uso de biomonitor, organismos bioindicadores que muestran efecto estrógeno. Se sabe que ciertos genes reaccionan sensiblemente al estrógeno en los organismos vivos.
La detección de productos genéticos por métodos moleculares también es posible a nivel de proteína o ARNm, pero generalmente implica sacrificio animal. Las leyes de protección animal se han vuelto cada vez más estrictas, y existe una creciente demanda de sistemas de prueba alternativos. Las tecnologías multigenéticas representan la posibilidad con este desarrollo y con el descubrimiento de proteínas fluorescentes, se ha allanado el camino para la creación de biomarcadores.
Con la ayuda de tales la activación de genes sensibles al estrógeno se puede probar in vivo. En este video, se muestra un posible método para el uso de embriones de pez cebra transgénico vtg:1mCherry para el ensayo de sustancias estrogénicas con la ayuda de dos compuestos. El protocolo puede servir como fondo para estudiar el efecto de estrógeno de diferentes muestras químicas o ambientales en embriones de biomarcadores.
La línea de peces cebra utilizada en nuestros experimentos es una línea de peces cebra transgénicos reportero de vitellogenin. La línea fue creada utilizando el sistema Tol2 Transposon. La construcción transgén utilizada para el desarrollo llevó la larga secuencia de promotor natural vitellogenin-1, con un alto número de lados ERI.
La expresión de la señal fluorescente en la hembra sexualmente madura es continua. Sin embargo, en los machos en embriones, sólo aparece por la acción o presencia de sustancias estrogénicas, por lo que estos últimos son más adecuados para las pruebas. La sensibilidad y usabilidad de los embriones de la línea se han probado en varios compuestos estrogénicos, así como en muestras ambientales.
Todos los experimentos en animales vivos se realizaron de acuerdo con la Ley Húngara de Bienestar Animal y todos los estudios se completaron antes de que los animales llegaran a la etapa de alimentación libre. Llene los tanques de apareamiento con agua del sistema y configure el pescado para aparearse antes de cosechar los huevos. Coloque peces machos y hembras en el tanque, y sepárelos con la ayuda de un divisor.
Retire el divisor de los tanques mientras la luz se enciende a la mañana siguiente. Revise los tanques de apareamiento en busca de huevos cada 15 a 20 minutos. Cosecha todos los embriones usando un colador de té, o malla fina densamente tejida, y combínalos en una gran placa de Petri con tampón E3, o agua clara del sistema.
Coloque los embriones en las incubadoras establecidos en 25,5 grados centígrados. Una a una hora y media después, retire y deseche los huevos no fertilizados, o los huevos divididos inadecuadamente con una pipeta de transferencia de plástico bajo un microscopio de disección. Colocar los embriones seleccionados en los recipientes de tratamiento, por ejemplo en platos Petri o placas de cultivo de tejidos, que ya han sido etiquetados y llenos de diferentes concentraciones de la sustancia de ensayo.
Incubar los embriones a 25,5 grados centígrados hasta el final del experimento. Actualizar la solución de prueba si es necesario para mantener la concentración del tratamiento. Tenga cuidado al cambiar la solución de prueba, con el fin de evitar dañar los embriones.
Preparar un cuatro por ciento de metoeladose con ms 222 de antemano. Coloque las larvas de cinco días de edad en un plato Petri de cinco centímetros por grupo de tratamiento con una pipeta de plástico. Retire la solución de tratamiento de las larvas con una pipeta de plástico, luego llene el plato De Petri con dos mililitros de 0.02 por ciento ms 222 solución anestésica.
Llene cada cuadrado de un plato Petri de 10 centímetros especialmente diseñado con un cuatro por ciento de metodosa ms 222. Transfiera las larvas anestesiadas a methoseladose con un poco de agua en uno de los dos cuadrados. Desde la primera plaza, transfiera las larvas a la segunda plaza.
En el segundo cuadrado, gire y oriente las larvas hacia su lado izquierdo y presione suavemente hacia abajo hasta la parte inferior de la con una punta de pipeta de microcargador cortada hasta dos centímetros. Para evaluar la señal del reportero expresado, imagine los embriones en la misma vista y configuración. Coloque el plato Petri en el escenario del microscopio.
Concéntrese en el hígado del embrión y capture una imagen de campo brillante utilizando el software asociado. Cambie el microscopio al filtro mCherry y tome una imagen florescente del hígado bajo luz fluorescente utilizando el software asociado. Repita los dos pasos anteriores hasta que haya capturado todos los embriones del experimento.
Abra ImageJ y, a continuación, cargue la imagen fluorescente que desea analizar arrastrando y soltando la imagen, o haciendo clic en Abrir archivo. Haga clic en Imagen, Color, Dividir canales para dividir la imagen hecha por el filtro florescente de acuerdo con el gráfico de colores RGB. Trabaje con el espectro de imágenes de canal rojo.
Cierre los otros canales. Designe un área elíptica de tamaño similar en la imagen, para que las señales completas no interfieran con la evaluación. Usando las herramientas ovaladas dibuje una elipse sobre el área del hígado resaltada con la mayor precisión posible.
Si la señal es débil, utilice imágenes microspic de luz, el par de campos brillantes de la imagen fluorescente, para determinar la ubicación del hígado. Haga clic en Analizar, Medir, para determinar la intensidad de la señal y el tamaño del área realizada. El valor de densidad integrado se calcula automáticamente mediante la columna de software en el gráfico.
Continúe el análisis repitiendo los pasos anteriores hasta analizar todas las imágenes de fluorescencia de todos los embriones en el grupo de tratamiento. Guarde los datos y, a continuación, analice los valores de densidad integrados. En el experimento, los embriones sensibles al estrógeno de la línea de peces cebra biomarcadores fueron tratados con 0,5 y ocho concentraciones de micromollas de alfa y beta-Zearalenol, o ZOL, para la fertilización hasta la edad de cinco días.
Investigamos si las señales florescentes aparecen en el hígado de los peces al final del experimento debido a sustancias, y si hay diferencias en la estrofia de las dos sustancias. Los resultados se evaluaron sobre la base de imágenes fluorescentes y valores de densidad integrados. En el caso de alfa-ZOL, en la concentración de prueba más alta, todos los individuos murieron.
Así que en este caso la señal fluorescente no pudo ser examinada. A concentraciones más bajas, se puede observar una señal fluorescente fuerte en el hígado del embrión. Sin diferencia significativa en la fuerza de la señal fluorescente y el tamaño de las áreas iluminadas.
Tampoco hubo diferencia significativa entre los valores de densidad integrados y los tratamientos. No hubo mortalidad durante el tratamiento con beta-ZOL. La sustancia indujo actividad transgénica en todas las concentraciones de tratamiento.
El aumento de la intensidad de la señal fluorescente, y el tamaño del área iluminada se puede observar en las imágenes de fluorescencia a medida que aumenta la concentración. Al examinar los valores integrados de beta-ZOL, este cambio también se puede descubrir. El valor medio de densidad integrada casi se duplica entre las concentraciones de tratamiento más bajas y más altas.
Sin embargo, en el caso de beta-ZOL, no encontramos diferencias significativas entre los valores de densidad integrados de las concentraciones individuales. Al examinar los valores de densidad integrados obtenidos a partir de las mismas concentraciones de tratamiento de las dos sustancias, se puede decir que alfa-ZOL dio mayores promedios de densidad integrados en cada caso en relación con beta-ZOL, lo que es coherente con las diferencias entre la intensidad de la señal observada en las imágenes fluorescentes. Esto diferencia con significativas en todas las concentraciones.
El uso de bioindicadores para efectos de estrógeno se ha extendido en estudios toxicológicos. Varias líneas transgénicas que muestran efectos de estrógeno también se han producido a partir de peces cebra, de los cuales vtg:1mCherry se utilizó en nuestros estudios. El método descrito aquí ilustra un posible protocolo para la prueba de embriones de esta línea, con el fin de permitir la detección in vivo de la actividad de estrógeno en caso de agentes puros.
Es importante mencionar que en el caso de los embriones, la expresión del transgén, de manera similar a la producción de vitellogenina endógena, muestra una gran dispersión, y las diferencias en la sensibilidad individual deben tenerse en cuenta al diseñar experimentos. Un aspecto importante para determinar las concentraciones de tratamiento es que las células de los embriones, incluidas las células hepáticas, pueden dañarse por concentraciones más altas de sustancias altamente tóxicas, lo que puede conducir a una disminución de la inducción de vitellogenina. Por lo tanto, las pruebas deben realizarse a concentraciones inferiores a L-C 10.
Este protocolo se puede modificar en muchos puntos de acuerdo con los puntos finales de prueba planificados y en las muestras que se van a probar. Se puede completar con otros métodos de prueba, por ejemplo métodos moleculares. Por lo tanto, esperamos que el uso de la línea vtg:1mCherry aparezca como un modelo de pruebas de estrogénicos y también puede ser un modelo para los métodos de prueba estandarizados.
