Estos métodos se utilizaron para desarrollar el primer modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma. Y demostrar que este modelo puede recapitular fielmente muchas características de la metástasis observada en pacientes con alto riesgo de neuroblastoma. La principal ventaja de este modelo metastásico de pez cebra es la obtención de imágenes in vivo en tiempo real de la diseminación del tumor para comprender mejor cuándo y, posiblemente, cómo se produce la metástasis.
Esta técnica no es específica del neuroblastoma. Se puede aplicar a modelos de pez cebra de diversos tipos de cáncer, siempre y cuando las células tumorales puedan ser identificadas y rastreadas, lo que lleva a una variedad de posibilidades. Para comenzar, desarrollar una línea de peces transgénicos heterocigotos que sobreexprese tanto MYCN como LMO1 mediante el cruzamiento de líneas transgénicas MYCN y LMO1.
Un día después de la fertilización, use un microscopio de fluorescencia estereoscópica para clasificar la progenie de outcross para la expresión de EGFP, que se presenta como puntos positivos de EGFP. Después de la clasificación, aísle los embriones examinados en placas de Petri separadas y etiquete los platos como MYCN positivo o MYCN negativo. Visualizar y clasificar embriones de ambos grupos para la expresión de LMO1 tres o cuatro días después de la fertilización.
Busque manchas rojas de fluorescencia tanto en el ganglio cervical superior como en las células neuronales dopaminérgicas no PSNS, especialmente en la médula oblonga del cerebro posterior. Realice el cribado antes de que los embriones alcancen los cinco días después de la fecundación. Luego aísle los peces clasificados en cuatro grupos de diferentes genotipos y etiquete como MYCN solamente, LMO1 solamente, MYCN y LMO1 ambos y tipo salvaje.
Elevarlos en idénticas condiciones según protocolos estándar. Visualice los tumores con un microscopio de fluorescencia estereoscópica volteando suavemente los peces con una espátula de metal en ambos lados laterales para ver el tumor. Después de la identificación de los posibles peces portadores de tumores, aíslelos en un tanque separado con etiquetas apropiadas que incluyan la fecha de nacimiento, la fecha en que se examinó el tumor y el genotipo.
A las seis semanas después de la fertilización, repita los pasos previos para detectar peces portadores de tumores y peces no portadores de tumores para confirmar la presencia de tumores para peces previamente examinados o identificar nuevos posibles peces portadores de tumores. Busque el tamaño sostenido o aumentado de la masa positiva de fluorescencia y los peces portadores de tumores confirmados. Después de identificar los peces portadores de tumores, monitoréelos quincenalmente para detectar evidencia de migración de células tumorales, que se presenta como pequeñas masas tumorales EGFP o mCherry positivas lejos del sitio primario de génesis tumoral.
Aísle estos peces en tanques separados según sea necesario y etiquete adecuadamente para indicar una posible metástasis. Después de interpretar el MYCN heterocigoto en peces LMO1, y mientras clasificaba su progenie, la expresión de EGFP MYCN fue prominente en las células neuronales dopaminérgicas no PSNS un día después de la fertilización. En contraste, la expresión de LMO1 fue prominente tanto en las células PSNS como en las células neuronales dopaminérgicas no PSNS.
Se detectaron masas tumorales fluorescentes positivas en tejidos de órganos, distantes del sitio tumoral primario en el compuesto de peces transgénicos con sobreexpresión de MYCN y LMO1, pero no en los peces transgénicos con la expresión de MYCN solo. La tinción H&E de las secciones quirúrgicas muestra que el tumor primario surgió de la región de la glándula interrenal, el equivalente de pez cebra de la glándula suprarrenal humana, que es el sitio más común de enfermedad primaria en pacientes con neuroblastoma. Se detectaron masas tumorales distantes de la glándula interrenal en múltiples regiones, incluida la porción distal del riñón, la órbita, las branquias, el bazo y la pared interna de la cámara auricular del corazón.
Se confirmó el linaje de neuroblastos PSNS de células tumorales en el tumor primario y en todos los sitios metastásicos. Se encontraron cantidades significativamente amplificadas y un mayor grosor de las fibras de colágeno teñidas con PSR en los tumores MYCN LMO1 en comparación con los tumores que expresan MYCN solos. Después de usar este procedimiento, se pueden aplicar nuevas terapias contra el cáncer de detección de medicamentos y pruebas, que potencialmente pueden conducir al desarrollo de agentes alternativos para prevenir y tratar los cánceres metastásicos.
