Este método práctico y reproducible se puede utilizar para visualizar las interacciones de leucocitos de endotelio que conducen al reclutamiento de leucocitos dentro de un ratón intacto. Esta técnica también presenta una poderosa herramienta para el seguimiento de los procesos fisiológicos y fisiopatológicos dentro de la cascada de reclutamiento de leucocitos in vivo. El método se puede aplicar en diferentes modelos inflamatorios y sépticos.
Por ejemplo, recientemente hemos destacado su relevancia en el estudio de las musculopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares. Nuestra sugerencia a otros científicos que están considerando usar esta técnica es obtener tanta experiencia práctica como sea posible, ya que el método es muy susceptible a desviaciones menores. Demostrando el procedimiento estará Simon Kranig, un clínico y científico senior de mi laboratorio.
Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco de los dedos en el animal experimental anestesiado, fijar el ratón en una posición dorsal reclinada en una almohadilla de calentamiento de 37 grados Celsius y utilizar una sutura estéril no absorbible 6-0 para enrollar un simple bucle alrededor de los dientes frontales. Pegue los extremos de unión de la sutura a la almohadilla de calentamiento y use pinzas para levantar suavemente la piel en la línea media. A continuación, haga una incisión circular de uno a dos centímetros de diámetro sobre el cuello y el tórax superior y use pinzas para diseccionar cuidadosamente el músculo circundante, la grasa y los tejidos conectivos.
Coloque una sutura debajo de la tráquea. Utilice tijeras quirúrgicas pequeñas para hacer un corte transversal de aproximadamente 1,3 milímetros en la tráquea e introduzca un tubo de polietileno en el extremo caudal de la tráquea para asegurar las vías respiratorias superiores. Fijar el tubo situado con una sola sutura de nudo circular y localizar la arteria carótida a lo largo del lado derecho de la tráquea.
Disecciona el tejido circundante de la pared de la arteria carótida y pasa dos trozos de sutura debajo de la arteria. Ate la primera sutura craneal proximal a la bifurcación de las arterias carótidas y coloque la segunda sutura de unos cinco a ocho milímetros distal desde la primera sutura sin atar. A continuación, coloque una pieza de 30 centímetros de tubo de polietileno en una aguja de jeringa de un mililitro llena de solución salina y utilice un clip de recipiente de siete milímetros para sujetar la arteria carótida distalmente a la segunda sutura.
Haga un corte transversal de aproximadamente 0,5 milímetros en la arteria carótida e introduzca el tubo de polietileno estéril en la arteria. Fije el tubo con la segunda sutura y retire el clip del recipiente. A continuación, presione suavemente el émbolo de la jeringa para que la solución salina entre en el recipiente.
Para preparar el músculo crema, transfiera el ratón a un marco de microscopio de plástico hecho a medida con el escroto mirando a la etapa del microscopio y agarre cuidadosamente el escroto en su extremo más distal con pinzas. Tirando suavemente del escroto, retire una sección circular de unos cinco milímetros de diámetro de la piel escrotal manteniendo el tejido abierto bien hidratado con solución salina. Utilice dos pinzas para diseccionar el tejido conectivo suelto y localizar ambos testículos.
Agarre un testículo distalmente y comience a extraer suavemente el tejido reproductivo eliminando los tejidos conectivos circundantes paso a paso. Una vez que el testículo ha sido exteriorizado, fijar el extremo distal del tejido al anillo de goma que rodea la etapa e hidratar el tejido con solución salina. A continuación, retire cuidadosamente el tejido conectivo sin dañar el músculo cremador subyacente.
Es fundamental eliminar todo el tejido conectivo que resultaría en imágenes borrosas sin dañar el músculo cremador subyacente. Cuando se haya extraído todo el tejido, haga una incisión transversal de un milímetro para abrir el músculo cremario antes de hacer una incisión longitudinal desde el extremo muy distal al extremo proximal del tejido. El músculo debe abrirse esféricamente.
Esparce cuidadosamente el músculo sobre la etapa de vidrio y fija el músculo al anillo de goma teniendo cuidado de no tocar o dañar la región central del tejido. A continuación, fijar el resto de testículos a un lado para dar acceso a la región de interés e hidratar el tejido con PSS. Para la visualización intravital de la vasculatura muscular, coloque el músculo cremamado montado en el microscopio vertical y seleccione el objetivo 40X.
Realizar las grabaciones bajo superfusión continua con 35 a 37 grados Celsius PSS a través de un pedazo de tubo pequeño que ha sido pegado al objetivo vertical del microscopio para permitir el goteo continuo de PSS junto con el objetivo hacia abajo en el músculo y el tejido. Identifique las venas post-capilares. Mida la microcirculación en venules con un diámetro de 20 a 40 micrómetros.
A continuación, registre imágenes de alta resolución de la microcirculación del músculo cremador durante un período de 30 segundos ajustando continuamente el enfoque debido a ligeros cambios en la contracción y relajación del tejido muscular. El exceso de tejido conectivo puede conducir a imágenes microscópicas borrosas. En esta imagen microscópica representativa, las venas post-capilares que deben tener entre 20 y 40 micrómetros de diámetro pueden ser identificadas por la confluencia de dos vasos más pequeños.
Los leucocitos adherentes y rodantes se pueden visualizar mientras que los leucocitos circulantes solo pueden ser rastreados en la reproducción a cámara lenta de los videos grabados. Una multitud de parámetros puede afectar el reclutamiento de leucocitos in vivo, incluyendo la salida cardíaca, el diámetro del vaso, la velocidad de la línea central, la velocidad de cizallamiento de la pared y el número de leucocitos circulantes. Tenga en cuenta que la velocidad de la línea central está influenciada por la salida cardíaca, la resistencia vascular periférica y el volumen intravasal.
Por ejemplo, un gran volumen de Rhodamine u otra sustancia experimental dada a través del catéter carótido aumenta la velocidad de la línea central post-capilar e inhibe la captura y la rodadura de leucocitos. Por el contrario, la insuficiencia cardíaca, la anestesia profunda o la hipotermia pueden disminuir el flujo post-capilar. Para determinar la velocidad de la línea central, se pueden utilizar leucocitos fluorescentes que circulan libremente o los leucocitos deben teñirse con reactivos fluorescentes como Rhodamine.
Tenga en cuenta que las cepas de tipo salvaje pueden mostrar varianza fisiológica. Por ejemplo, los ratones C57BL/6 demuestran laminación, adhesión y transmigración de leucocitos claramente mejoradas en comparación con los animales C57BL/10ScSn. Las etapas de planificación y estandarización son importantes para dominar la técnica, especialmente durante la preparación del músculo cremador para microscopía.
Se pueden llevar a cabo otros métodos para visualizar el reclutamiento de leucocitos para producir información adicional y ayudar a diseccionar la contribución individual de leucocitos y células endoteliales a la cascada de reclutamiento. Esta técnica proporciona una plataforma para la evaluación preclínica de meditadores farmacológicos y nuevas sustancias moduladoras inmunitarias.
