Investigación en el laboratorio de los autores con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R37-HL041026, R01 y R01-HL086483 HL056786 (SSS) y F32-HL097463 y T32 AR048523 (PB) del Servicio de Salud Pública de Estados Unidos.

1. Ratón bordo, pedestal del músculo, la cuña del cuerpo y la solución de superfusión <ol><li> Ratón bordo: A bordo de plexiglás transparente rectangular (6 &quot;de ancho x 8&quot; de largo x 3.16 &quot;de espesor) se hace para caber en el escenario del microscopio.&quot; Tablero del ratón &quot;es donde el ratón anestesiado se asegura durante la preparación quirúrgica de el músculo cremáster. </li><li> Pedestal del músculo: Un pedestal transparente de goma silastic se prepara a partir Sylgard 184, que se mezcla de acuerdo a las instrucciones del s · Fabricante. Un molde es una práctica de 15 mm de espesor x 50 mm de diámetro de plato de Petri desechables de diámetro. El bloque Sylgard se corta a la forma deseada con una cuchilla de afeitar (ver Figura 1C).. Una fina capa de silicona adhesiva transparente a prueba de agua se utiliza para fijar el bloque Sylgard a la junta del ratón. Consejos útiles: Después de verter el Sylgard en la placa de Petri, de desgasificación en una cámara de vacío durante una hora, elimina las burbujas de aire y mejora la claridad. Después de la desgasificación, el tiempo de curado de Sylgard se acorta mediante la colocación de la cápsula en un horno de laboratorio a 50 ° C durante varias horas. </li><li> Cuña del cuerpo y la plataforma de calefacción: una cuña (2 &quot;x 4&quot; x 15 °) situado debajo del ratón y contra el pedestal se inclina el cuerpo hacia adelante que facilita la ampliación del músculo cremáster sobre el pedestal de su origen. La incorporación de una plataforma de aluminio sobre la superficie proporciona calor por conducción. La plataforma es calentado por resistencias conectadas a una fuente de alimentación DC (Figura 1). Calibración de la temperatura de la plataforma a 40 ° C mantiene la temperatura del esófago a ~ 37 ° C. De lo contrario, el calor radiante de una lámpara se utiliza. </li><li> Pins. Para asegurar el músculo cremáster en el pedestal, pines están preparados a partir de 0,15 mm alfileres de insectos que se han doblado en forma de &quot;L&quot; forma. </li><li> Solución salina fisiológica (PSS). Los preparativos están superfused (riego) de forma continua con bicarbonato de búfer PSS preparado en agua ultrapura (18,2 MW) H 2 O. Las soluciones madre se preparan en 20 veces la concentración final de trabajo y se esteriliza a través de un filtro de 0,2 micras. Disponibilidad de soluciones siguen siendo buenas durante varias semanas cuando se almacenan a 4 ° C. La preparación de sales por separado el bicarbonato y mezclar con la dilución en el día del experimento evita la precipitación de bicarbonato de calcio. La solución de sal para el ganado se compone de (en mmol / L): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 4, el 23,4 CaCl2. El bicarbonato de valores es de 360 NaHCO3. En el día de un experimento, las soluciones respectivas son llevados a un volumen final (normalmente 2 L para un experimento dado) en un matraz aforado y se coloca en un baño de agua a ~ 37 ° C. Equilibrar la PSS con un 5% de CO 2 / 95% N 2 de ~ 15 minutos con un dispersor de gas se ajusta el pH a 7.4 ~ y evita la precipitación. El PSS se burbujea continuamente con CO2 al 5% / 95% de N 2 a través de experimentos. La composición final de solución de trabajo (en mmol / L) es: 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgS0 4, 2 CaCl2, 18 de NaHCO3. </li></ol> 2. Anestesia y preparación para la cirugía <ol><li> Tras la aprobación del Cuidado de Animales institucional y el empleo, los ratones machos de al menos 12 semanas de edad se utilizan. El ratón es anestesiados con pentobarbital sódico (60 mg / kg) vía intraperitoneal (ip). Un tubo de restricción sea de utilidad para asegurar el ratón durante la inyección inicial. A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y protocolos experimentales, la anestesia se mantiene con los suplementos (10-20% de la inyección inicial, ip), según sea necesario (cada 30-60 minutos, se indica por la respuesta de la retirada a los pies o pellizcar la cola). Consejo: La dilución de la pentobarbital 10 mg / ml en solución salina estéril antes de la inyección reduce la posibilidad de sobredosis. </li><li> Anestesia compromisos regulación de la temperatura por lo que el ratón debe ser mantenido caliente inmediatamente después de la primera inyección. Situar el ratón en una jaula de metal (cesta ventilada de aluminio) en la parte superior de una placa calefactora (calibrado a ~ 37 ° C) funciona bien. Por otra parte, una lámpara de calor se puede utilizar con cuidado de que la posición a una distancia apropiada del ratón. El ratón debe ser tomada cada 5-10 minutos hasta que el nivel adecuado de anestesia se consigue (la falta de retiro a los pies o pellizcar la cola). Una dosis suplementaria puede ser necesaria después de 15-20 minutos. Lo mejor es ser paciente y proceder con cautela para evitar una sobredosis, especialmente en los animales obesos o de edad avanzada. </li><li> El pelo se elimina de la parte inferior del abdomen, la espalda baja, el escroto y las piernas cuidadosamente afeitado respectivas regiones. Se debe prestar especial cuidado para evitar un traumatismo en el escroto y los testículos, que de otra forma dañar el músculo cremáster. Quitar el pelo suelto con un hisopo con alcohol. </li><li> Si la vejiga está llena, se siente como una uva pequeña a través de la pared abdominal. Vaciar la vejiga con una presión suave para evitar que el ratón de orinar en la preparación cremáster durante los experimentos. A Kimwipe es una esponja de la validez de colecciónt la orina. </li><li> Coloque el ratón sobre la espalda, acostado en la cuña con sus piernas a horcajadas del pedestal. Una sutura de seda (4-0 o 5-0) empató a cada pie tiene una correa de sujeción para asegurar el ratón con su entrepierna contra el pedestal. Un pedazo de cinta adhesiva colocada libremente en el pecho y aseguró que la cuña mantiene la posición del cuerpo en general. Los procedimientos quirúrgicos se realizan mientras se visualiza a través de un microscopio estereoscópico con tijeras y pinzas en ángulo microdisección. </li></ol> 3. Preparación quirúrgica del músculo cremáster abierto <ol><li> Un pin se coloca a través del ápice de la bolsa escrotal (ya sea la izquierda o la derecha) y se asegura en el pedestal para colocar la tensión en la piel. Superfusión con PSS (34-35 ° C) se inicia en el campo quirúrgico y se mantiene durante la disección de mantener el tejido expuesto cálido y húmedo. Una mecha (a partir de Kimwipe) colocados con un extremo junto a la bolsa escrotal y el otro junto a una línea de vacío elimina el PSS de efluentes. Una capa de sellador de silicona adherida a la placa de plexiglás y completa que rodea la cuña y el pedestal sirve como &quot;foso&quot; para recoger el PSS que no se aspira, que actúa como una eficaz medida de precaución para evitar fugas de PSS en el microscopio. </li><li> Se hace una incisión a lo largo de la superficie ventral del saco escrotal. Si el testículo se ha retraído por el músculo cremáster en la cavidad abdominal, una ligera presión en el abdomen inferior dirige el testículo en el saco. La superficie del músculo cremáster que recubre los testículos se deben identificar en este momento. Tejido conjuntivo entre la piel del escroto y el músculo cremáster se retira cuidadosamente para liberar el músculo cremáster del tejido circundante. </li><li> La piel del escroto está ligeramente retraído por detrás del borde proximal del pedestal y se asegura a cada lado con un alfiler. La superficie exterior de la superficie del músculo cremáster se borra del tejido conectivo. Superfusión continua durante los hidratos de disección del tejido conectivo, lo que facilita la visibilidad y la eliminación. </li><li> Un alfiler en el vértice del músculo cremáster se utiliza para ponerlo bajo tensión longitudinal. Se hace una incisión longitudinal a través de la superficie ventral del músculo con gran cuidado para reducir al mínimo la interrupción del suministro vascular. La dinámica del flujo de sangre cerca de la periferia de la preparación se ven alterados por este daño en los tejidos 14. Por lo tanto, para minimizar estos efectos en la recopilación de datos, los vasos sanguíneos cerca del centro de la preparación se utilizan para la imagen y los estudios fisiológicos. </li><li> El músculo cremáster está conectado por un ligamento delgada en el epidídimo por debajo de los testículos. Como reflejo de los testículos a un lado expone este ligamento, que se separa cuidadosamente del epidídimo. Cerca de la punta del músculo cremáster es pequeña arteria y la vena que se conecta al epidídimo. Oclusión de los vasos entre las pinzas y tirando de ellos, aparte minimiza el sangrado. El testículo, el epidídimo, la arteria y la vena testicular se ligan proximal (4-0 o 5-0 sutura de seda), cortado y desechado (orquiectomía), junto con la almohadilla de grasa inguinal asociada. Por otra parte, el testículo puede volver a colocarse suavemente en la cavidad abdominal y retenido con un trozo de algodón o Kimwipe. La orquiectomía sirve para evitar el posible trauma a los tejidos cuando se empuja los testículos en la cavidad abdominal. No hemos encontrado diferencias notables en la calidad de la preparación de la microcirculación cremáster (ver sección 3.8) mediante el procedimiento 7,15. </li><li> La superficie externa del músculo cremáster, se elimina el tejido conectivo restantes y luego se extendió radialmente sobre la superficie del pedestal. Los bordes están aseguradas con clavijas (ver sección 1.4) en 5-6 lugares para crear una hoja plana de músculo estriado con microcirculación intacta. </li><li> La preparación completa se transfiere a la etapa de un microscopio intravital, superfused continua (3-5 ml / min, 34 ° C) y se equilibra durante 30 minutos. </li><li> La integridad de la preparación cremáster se evalúa de acuerdo a varios criterios. Espontánea tono vasomotor con un mínimo trauma quirúrgico está indicado por el flujo rápido en las arteriolas y la falta de leucocitos adheridos en las vénulas. El índice más sensible de una preparación de respuesta es la constricción de las arteriolas a elevar la solución de superfusión contenido de oxígeno durante 5-10 minutos. Esto se hace equilibrar con un 21% de O 2 (frente al 5% O 2, véase la sección 1.5, todos con 5% de CO 2, el balance de N 2). La presencia de leucocitos en las arteriolas, la ausencia de las células rojas de la sangre que fluye a través de los capilares, y / o leucocitos se acumulan en las vénulas y los tejidos circundantes son signos de daño en los tejidos y la inflamación. </li></ol> 4. Intravital imagen de la microcirculación del músculo cremáster <ol><li> Intravital de imágenes se realiza en un microscopio personalizado basado en una plataforma de Olympus MVX10 Zoom Estéreo. El microscopio MVX10 cuerpose monta en un híbrido MVX10 stand equipado con transiluminación (lámpara halógena) para campo claro (Köhler) de imágenes y con epi-iluminación (lámparas de mercurio) para imágenes de fluorescencia. Epi-iluminación, GCaMP2 se complace en nm 472/30 con la emisión recogidos en nm 520/35. Las imágenes se adquieren a través de una MV PLAPO 2xc objetivo (apertura numérica = 0,50; Olympus) con una intensificación de XR/Mega-10 cámara digital (Stanford Photonics, Inc., SPI) a través de Piper Control de Software (SPI) en un ordenador personal. Con este sistema, el campo observado de visión (FOV) puede variar de 553 m X 442 micras a 22 mm X 18 mm. </li><li> Al término de los experimentos de imagen intravital, el ratón anestesiado es la eutanasia con sobredosis de pentobarbital seguido por dislocación cervical. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ratón bordo de imagen intravital de la preparación del ratón cremáster. A) Cuerpo de cuña con plataforma de aluminio (aislados con plástico de color amarillo) se ve desde la parte inferior. Resistencias calentadoras asegurado a la parte inferior de la plataforma de proporcionar calor a cabo. B) La plataforma de calefacción se basa en una cuña de plástico. C) La cuña cuerpo es colocado en un tablero de acrílico para la cirugía y posterior traslado a la platina del microscopio intravital. Pedestal Sylgard se indica con la flecha roja. Un cordón de silicona resistente al agua rodea toda la preparación que contenga cualquier solución que pueden tener fugas durante el procedimiento intravital, evitando que caigan gotas en el microscopio. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Personalizado microscopio de campo amplio MacroZoom imágenes. A) MVX10 cuerpo del microscopio (Olympus) con XR/Mega-10 cámara ICCD (Stanford Photonics) montado en el puerto trinocular. B) Vista cercana del cuerpo del microscopio. (A) control de zoom (0,63 a 6.3x), (b) la rueda de filtros, (c) la imagen doblador (NA = 0,50 con un aumento óptico de 25X). C) Subetapa condensador de campo claro (Köhler) iluminación (Condensador NA = 0,55, distancia de trabajo = 27 mm). <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Completado ratón preparación cremáster. Ratón anestesiado en posición supina en la plataforma de calentamiento de aluminio recubierto de plástico (amarillo). La posición del cuerpo está asegurada con cinta adhesiva. El músculo cremáster se propaga radialmente en el pedestal de goma silastic transparente y articulada en los bordes. Solución de superfusión se introduce en el extremo proximal a través de un gotero de plástico (flecha blanca). Una línea de vacío (blanco punta de flecha) elimina la solución a través de una mecha Kimwipe. Dos micropipetas se muestran posicionado con sus consejos en el tejido. Un electrodo de referencia (hilo de plata) se fija en el borde inferior del músculo cremáster. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ilustrar el rango de aumentos para la visualización de redes arteriolar expresar GCaMP2 en el endotelio. A) Imagen campo claro fluorescentes y B) tomadas en un aumento óptico de 3.2x para una ampliación total = 42X en el monitor de vídeo. [Campo de visión (FOV) = 4,375 x 3,470 m]. Barra de escala = 500 micras. Trabajar en este aumento facilita la colocación de micropipetas a los lugares deseados. C) fluorescentes y D) la imagen tomada en campo claro aumento óptico de 6.4X de magnificación total = 83x (FOV = 2.200 x 1.759 mm). Barra de escala = 200 micras. E) fluorescentes y F) de imágenes tomadas en campo claro aumento óptico de 12.6X para un aumento total = 165X (FOV = 1.100 x 885 mm). Barra de escala = 100 micras. G) Con doblador de la imagen, magnificación óptica = 25.2X. Barra de escala = 50 micras.

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	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats.">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li><li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle.">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li><li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

Todos los procedimientos y protocolos con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad de Missouri y realizado de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La producción de este video-artículo ha sido patrocinado por Stanford Fotónica.

A continuación se describe la preparación abierta cremáster muscular en el ratón para observar la microcirculación in vivo. Este procedimiento sigue el modelo de la preparación &quot;abierto&quot; cremáster describió por primera vez en la rata 4. Con la práctica del procedimiento quirúrgico se puede completar en menos de una hora. La versatilidad de esta preparación permite una variedad de manipulaciones experimentales y se adapta fácilmente a los hámsters y ratas, lo que permite una gran variedad de modelos experimentales para estudiar de manera similar. La preparación se limita a los machos y las mediciones deben realizarse hacia el centro del tejido, evitando las regiones dañadas cerca de los bordes del músculo 14. También hay que reconocer que, mientras que las distribuciones de presión y el flujo se altera cuando los vasos de interconexión del músculo cremáster se cortan 16 de microvasos mostrándose receptiva y adecuada para la recogida de datos reproducibles. La principal limitación a la visualización de la microcirculación en el músculo cremáster es la acumulación de tejido conectivo como animales maduros y aumentan de tamaño, especialmente en las ratas, sino también en los hámsteres. Además, como animales de engorda, se vuelve más difícil de controlar debido a la anestesia con pentobarbital es lipofílico y puede ser absorbido en el tejido adiposo. La mejor manera de proceder es ser paciente al tiempo que garantiza que la temperatura del · s de los animales del cuerpo se mantiene a ~ 37 ° C mientras que el tejido expuesto se riega continuamente con PSS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo o dispositivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Pescador </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de Potasio </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de magnesio </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Sigma </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de Sodio </td><td> Pescador </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de sodio Nembutal </td><td> Lundbeck </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> También se conoce como el pentobarbital sódico </td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Warner Instrumentos </td><td> TC-344B </td><td> Suplente: ajustable de 12V DC fuente de alimentación </td></tr><tr><td> Serie de plataforma de 20 kit de calefacción RH-2 </td><td> Warner Instrumentos </td><td> 64-0274 </td><td> Requiere de costumbre-construido placa de aluminio </td></tr><tr><td> Mega-10 Cámara </td><td> Stanford Fotónica </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2xc lente </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 soporte híbrido </td><td> Leeds </td><td> LBX-Hybrid </td><td></td></tr><tr><td> Piper Control de Software </td><td> Stanford Fotónica </td><td></td><td> Programa de Mega-10 cámara </td></tr><tr><td> Microscopio estéreo </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Sellador de silicona resistente al agua (Borrar) </td><td> General Electric </td><td> 47970-72643-LW5000 </td><td> Otros selladores de silicona claro también el trabajo </td></tr><tr><td> 60 x 15 mm Petri </td><td> Pescador </td><td> 08 a 757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras microdisección </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont Pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore Express PLUS membrana </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens Pines insectos </td><td> Austerlitz </td><td> Talla M 0,15 mm </td><td></td></tr><tr><td> Trimmer mascotas compacto </td><td> Wahl Clipper Corp. </td><td> Modelo 9966 </td><td> Limpia después de cada uso </td></tr></tbody></table>

the mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation

En todo el cuerpo, el mantenimiento de la homeostasis requiere el suministro constante de oxígeno y nutrientes concomitante con la eliminación de los subproductos metabólicos. Este equilibrio se consigue por el movimiento de la sangre a través de la microcirculación, que abarca las ramas más pequeñas de la vascularización en todos los tejidos y órganos. Las arteriolas de las arterias para formar redes que controlan la distribución y magnitud de la sangre oxigenada que fluye en la multitud de capilares íntimamente asociado con las células del parénquima. Capilares proporcionan una gran superficie para el intercambio de difusión entre las células del tejido y el suministro de sangre. Vénulas capilares recogen los efluentes y convergen a medida que regresan la sangre desoxigenada hacia el corazón. Para observar estos procesos en tiempo real requiere un enfoque experimental para la visualización y la manipulación de la microcirculación de vida. El músculo cremáster de ratas fue utilizado por primera vez como un modelo para el estudio de la inflamación mediante histología y microscopía electrónica de 1,2 post mortem. La primera en el informe in vivo de la exposición del músculo cremáster de ratas intactas investigado las respuestas a los fármacos vasoactivos microvascular con la luz reflejada 3. Sin embargo, la curvatura del músculo y la falta de iluminación enfocada limita la utilidad de esta preparación. El gran avance supuso la apertura de los músculos, separándolo del testículo y la difusión radial que como una hoja plana de la transiluminación con un microscopio compuesto 4. Mientras demostrado ser una valiosa preparación para estudiar la fisiología de la microcirculación en ratas y hámsters, 5 6, el músculo cremáster en ratones 7 ha demostrado ser particularmente útil en la disección de los mecanismos celulares implicados en la regulación de la función microvascular 8-11 y en tiempo real imágenes de intercelular señalización 12. El músculo cremáster se deriva de los músculos abdominales oblicuo interno y transverso ya que los testículos descienden a través del canal inguinal 13. Que sirve de apoyo (en griego: cremáster suspender =) y mantener la temperatura de los testículos. Como se describe aquí, el músculo cremáster se prepara como una fina hoja plana para la resolución óptica excepcional. Con el ratón mantiene a una temperatura corporal estable y el plano de la anestesia, preparación quirúrgica consiste en liberar el músculo del tejido circundante y los testículos, extendiéndola en pedestal transparente de goma de silastic y asegurar los bordes con alfileres de insectos, mientras que el riego continuo con solución salina fisiológica . El presente protocolo utiliza ratones transgénicos que expresan GCaMP2 en arteriolar las células endoteliales. GCaMP2 es genéticamente codificados indicador fluorescente de calcio 12 molécula. Campo amplio de imágenes y una intensificación de carga acoplada cámara del dispositivo permite el estudio in vivo de la señalización del calcio en el endotelio arteriolar.

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The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

A la preparación del tejido se describe para la visualización y la manipulación experimental de la microcirculación de vida. En los ratones macho anestesiado, el delgado y muy vascularizado músculo cremáster se prepararon para microscopía intravital para estudiar las redes microvasculares como las arteriolas, capilares y vénulas. Esta preparación se adapta fácilmente a las ratas y hámsters.

El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

32.1K vistas.  University of Missouri. A la preparación del tejido se describe para la visualización y la manipulación experimental de la microcirculación de vida. En los ratones macho anestesiado, el delgado y muy vascularizado músculo cremáster se prepararon para microscopía intravital para estudiar las redes microvasculares como las arteriolas, capilares y vénulas. Esta preparación se adapta fácilmente a las ratas y hámsters.

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Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis y micromanipulación de imagen intravital de fluorescencia de la microcirculación

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Investigación

Biología

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Un método versátil para el montaje de Arabidopsis las hojas para la proyección de imagen de Time-lapse Intravital

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un ensayo de quimiotaxis mejorado para la identificación rápida de quimioatrayentes rizobacterianos en exudados radiculares

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...