Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la heterogeneidad y las propiedades funcionales de las células epiteliales amnióticas humanas aisladas de la membrana amniótica. Mientras que los protocolos anteriores aislan las células de la membrana co-amniótica sin discernir entre regiones, nuestro protocolo permite el cultivo de la población celular aislada de tres regiones anatómicas distintas. Para separar la membrana amniótica por región, en un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles, identifique el amnion umbilical que envuelve el cordón umbilical, el amnion placentario que cubre la decidua basalis, y la región reflejada, que se considera el resto de la amnión que no está unida a la placenta.
Para diseccionar la región umbilical del amnion, utilice fórceps diseccionantes para sostener la porción de la membrana de amnión que cubre la unión de la placenta y el cordón umbilical, y use un bisturí para diseccionar la región que rodea el cordón, mientras se estira para separar la región de la coral. A continuación, deposite el tejido separado en un vaso de precipitados etiquetado con 100 mililitros de solución salina. Para diseccionar la región del amnion placentario, utilice una gasa de algodón estéril para eliminar los coágulos sanguíneos de la superficie de la coral/amnion que cubre la placenta.
Y usa fórceps diseccionados para agarrar la membrana en el borde entre la placenta y la región reflejada. Utilice un bisturí para cortar a lo largo de la circunferencia de la placenta y separar el aluz placentario de la coral, teniendo cuidado de no cortar ningún vaso de la placenta. Coloque el tejido separado en otro vaso de precipitados etiquetado con 300 mililitros de solución salina.
Y separar el resto de la membrana amniótica que no está unida a la placenta de la coral. A continuación, coloque la región reflejada en otro vaso de precipitados etiquetado con 300 mililitros de solución salina. Para lavar las membranas, utilice pinzas para colocarlas en una superficie estéril para poder desechar la solución salina de cada recipiente de tejido.
Vuelva a colocar las membranas en el recipiente y agregue 100 mililitros de solución salina fresca a la región umbilical y 300 mililitros de solución salina fresca a las regiones placentarias y reflejadas. Utilice fórceps diseccionantes para agitar las membranas para eliminar cualquier residuo de sangre y colocar las membranas en la superficie estéril para poder desechar las soluciones salinas. Luego, lave las membranas al menos dos veces más, como se acaba de demostrar, hasta que los tejidos sean translúcidos.
Para la digestión enzimática de las diferentes regiones de la membrana amniótica, corte las regiones reflejadas y placentarias en dos o tres fragmentos. Y coloque los fragmentos y la región umbilical en tubos individuales de centrífuga de 50 mililitros. Añadir 20 mililitros de 0,5%trypsin-EDTA a cada tubo de fragmentos de tejido de región reflejada y placentaria y cinco mililitros de 0,5% de tripsina-EDTA al tubo que contiene el tejido de la región umbilical.
Agitar suavemente los tubos durante 30 segundos. A continuación, coloque las membranas sobre una superficie estéril, descartando la solución de trippsina-EDTA y sustituyéndola con 30 mililitros de 0,5% de tripsina-EDTA para los fragmentos de tejido de la región reflejada y placentaria y 15 mililitros de 0,5% de Trypsin-EDTA fresco para el tejido de la región umbilical. A continuación, coloque los tubos en un rotador dentro de una incubadora para una rotación de 40 minutos a 20 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, transfiera todo el volumen de la solución celular a nuevos tubos cónicos. Y agregue dos veces el volumen de 37 grados-Celsius AE humano células AE medio a cada tubo en el hielo. Digerir cualquier fragmento de tejido sobrante en los tubos originales con 0.5%trypsin-EDTA fresco, como se acaba de demostrar.
Al final de la segunda digestión, utilice un par de fórceps diseccionados para contener un extremo de la porción de amnión y un segundo par de fórceps diseccionados para exprimir a lo largo del tejido restante para eliminar cualquier fila de células epiteliales que no se despegó completamente durante los períodos de incubación anteriores. A continuación, retire las membranas para poder transferir la segunda solución de digestión a un segundo conjunto de tubos centrífugos. Y inactivar las enzimas de digestión con el doble de volumen de medio fresco de células AE humanas de 37 grados-Celsius sobre hielo.
Para el aislamiento humano de células AE, sedimentar las células por centrifugación. Y resuspender el pellet en cada tubo con 10 mililitros de medio celular AE humano fresco de 37 grados-Celsius. Tire de cada par de digestiones en un solo tubo y filtre las suspensiones a través de coladores de 100 micrómetros para eliminar cualquier residulante de matriz extracelular.
Después de contar, siembra las células AE humanas de cada una de las tres regiones en placas individuales de 100 milímetros a tres veces 10 a las cuartas células por centímetros de concentración cuadrada en medio de células AE humanas de 37 grados-Celsius, complementadas con 10 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento epidérmico humano. Luego, incubar los cultivos a 37 grados celsius en condiciones normóxias en una incubadora humidificada hasta el análisis posterior de interés. Después de 48 horas de cultivo, las células AE humanas con un fenotipo epitelial se adhieren a la superficie de la placa, mientras que el sobrenadante contiene desechos celulares y células flotantes que se pueden eliminar una vez que se cambia el medio.
Es aconsejable desechar los cultivos y procesar otra membrana al identificar la presencia de contaminación bacteriana, eritrocitos excesivos debido al lavado insuficiente de las membranas, células deficientes o no adherentes, o células con una morfología de fibroblastos. La morfología celular de AE humana depende del origen de las células, ya que las células de la zona reflejada demuestran una morfología cuboidal y crecen en una monocapa adoquinada, y las células de las regiones placentaria y umbilical son más planas y escamosas. La inmunofluorescencia contra la cadherina E revela que los cultivos primarios y las subculturas mantienen su fenotipo epitelial, lo que sugiere que no hay contaminación de otro tipo de célula.
Además, las células son viables, como lo demuestra su expresión del marcador de proliferación Ki-67. Aunque las subpoblaciones del amnión difieren en su morfología y función, la expresión y presencia del núcleo de los factores de pluripotencia no cambia en las células AE humanas derivadas de las regiones placentarias y reflejadas. Dado que las células epiteliales amnióticas humanas son una posible fuente de células madre pluripotentes, podemos desafiarlas a través de una línea de protocolos de definición específicos para dilucidar si estas células de cada región tienen diferentes potenciales.
Antes de un protocolo iniciado, revise la historia clínica del paciente para asegurarse de que el tejido no presenta características microbiológicas de la infección.
