Этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы о неоднородности и функциональных свойствах амниотических эпителиальных клеток человека, изолированных от амниотической мембраны. В то время как предыдущие протоколы изолировали клетки от коамниотической мембраны, не различив между регионами, наш протокол позволяет культуре популяции клеток, изолированных от трех различных анатомических областей. Чтобы отделить амниотическую мембрану по регионам, в кабинете биобезопасности в стерильных условиях, определите пуповину, обволакивающую пуповину, плацентарную амницию, покрывающую базалис decidua, и отраженную область, которая считается остальной частью амниона, который не прикреплен к плаценте.
Чтобы вскрыть область пуповины, используйте рассечение типсов, чтобы удерживать часть мембраны амниона, которая покрывает соединение плаценты и пуповины, и использовать скальпель, чтобы вскрыть область, которая окружает шнур, в то время как растяжение, чтобы отделить область от хориона. Затем сдай отделенную ткань в помеченный стакан 100 миллилитров солевого раствора. Чтобы вскрыть плацентарный регион амниона, используйте стерильную хлопчатобумажную марлю, чтобы удалить сгустки крови с поверхности хориона/амниона, который покрывает плаценту.
И использовать рассечение типсов, чтобы схватить мембрану на границе между плацентой и отраженной области. Используйте скальпель, чтобы сократить вдоль окружности плаценты и отделить плацентарный амнион от хориона, будучи осторожным, чтобы не вырезать любые сосуды из плаценты. Поместите отделенную ткань в другой помеченный стакан с 300 миллилитров солевого раствора.
И отделить остальную часть амниотической мембраны, которая не прикреплена к плаценте от хориона. Затем поместите отраженную область в другой помеченный стакан с 300 миллилитров солевого раствора. Для мытья мембран используйте пинцет, чтобы поместить их на стерильную поверхность, чтобы иметь возможность отказаться от солевого раствора из каждого контейнера ткани.
Поместите мембраны обратно в контейнер и добавьте 100 миллилитров свежего солевого раствора в область пупочной и 300 миллилитров свежего солевого раствора в плацентарные и отраженные области. Используйте рассечение типсов, чтобы перемешать мембраны, чтобы удалить остатки крови и поместить мембраны на стерильной поверхности, чтобы иметь возможность отказаться от солевые растворы. Затем, мыть мембраны по крайней мере еще два раза, как только что показали, пока ткани полупрозрачные.
Для энзиматического пищеварения различных областей амниотической мембраны, разрежьте отраженные и плацентарный области на два или три фрагмента. И поместите фрагменты и пуповину в отдельные 50-миллилитровые центрифуги труб. Добавьте 20 миллилитров 0,5%трипсина-ЭДТА к каждой трубке отраженных и плацентарных фрагментов тканей области и пять миллилитров 0,5%трипсина-ЭДТА к трубке, содержащей ткани пуповинной области.
Встряхните трубки осторожно в течение 30 секунд. Затем поместите мембраны на стерильную поверхность, отбрасывая раствор трипсина-ЭДТА и замените его 30 миллилитров свежего 0,5%трипсина-ЭДТА для отраженных и плацентарных фрагментов тканей области и 15 миллилитров свежих 0,5%трипсина-ЭДТА для ткани пупочной области. Затем поместите трубки в ротатор внутри инкубатора для 40-минутного вращения при 20 вращениях в минуту при 37 градусах цельсия.
В конце инкубации перенесите весь объем клеточного раствора в новые конические трубки. И добавить в два раза объем 37-градусного Цельсия человеческих клеток АЕ среднего к каждой трубке на льду. Переварить любые остатки фрагментов ткани в оригинальных трубках со свежим 0,5%трипсин-ЭДТА, как только что показали.
В конце второго пищеварения, используйте пару рассечения типсов, чтобы провести один конец части амниона и вторую пару рассечения типсов, чтобы сжать вдоль оставшейся ткани, чтобы удалить любые ряды эпителиальных клеток, которые не полностью отслаиваются в течение предыдущих инкубационных периодов. Затем удалите мембраны, чтобы иметь возможность перенести второй раствор пищеварения во второй набор центрифуг трубки. И инактивировать ферменты пищеварения с в два раза объем свежей 37-градусной-Цельсия человека А.Е. клеточной среды на льду.
Для изоляции клеток АЕ, осадок клеток центрифугации. И повторно помесить гранулы в каждой трубке с 10 миллилитров свежих 37-градусных-celsius человека АЕ клеточной среды. Вытяните каждую пару пищеварений в одну трубку и фильтруем подвески через 100-микрометровые ситечко, чтобы удалить любой внеклеточный матричный мусор.
После подсчета, семена человеческих клеток АЕ из каждого из трех регионов в отдельных 100-миллиметровых пластин в три раза от 10 до четвертого клетки на сантиметры в квадрате концентрации в 37-градусный цельсий человека АЕ клеточной среды, дополненный 10 нанограмм на миллилитр человеческого эпидермального фактора роста. Затем инкубировать культуры на 37 градусов по Цельсию в нормоксических условиях в увлажненные инкубатор до вниз по течению анализ интереса. После 48 часов культуры, человеческие клетки АЕ с эпителиальным фенотипом прилипают к поверхности пластины, в то время как супернатант содержит клеточный мусор и плавающие клетки, которые могут быть удалены после изменения среды.
Целесообразно отказаться от культур и обработать другую мембрану при выявлении наличия бактериального загрязнения, чрезмерного эритроцитов из-за недостаточного мытья мембран, недостаточно или неадхерентных клеток, или клеток с фибробластовой морфологией. Морфология клеток человека АЕ зависит от происхождения клеток, так как клетки из отраженной зоны демонстрируют кубоидную морфологию и растут в мощеном монослойном, а клетки из плацентарный и пуповинной области льстит и плоскоклеточный. Иммунофлюоресценция против Е-кадгерина показывает, что первичные культуры и субкультуры сохраняют свой эпителиальный фенотип, предполагая, что нет загрязнения другого типа клеток.
Кроме того, клетки жизнеспособны, о чем свидетельствует их выражение маркера распространения Ки-67. Хотя субпопуляции от амниона отличаются по своей морфологии и функции, экспрессия и присутствие ядра факторов плюрипотенции не меняется в клетках АЕ человека, полученных из плацентарных и отраженных областей. Поскольку амниотические эпителиальные клетки человека являются возможным источником плюрипотентных стволовых клеток, мы можем бросить им вызов с помощью линии конкретных протоколов определения, чтобы выяснить, имеют ли эти клетки из каждого региона различные потенциалы.
До начала протокола, обзор истории болезни пациента, чтобы убедиться, что ткань не проявляет микробиологических характеристик инфекции.
