Bu protokol, amniyotik membrandan izole edilmiş insan amniyotik epitel hücrelerinin heterojenliği ve fonksiyonel özellikleri ile ilgili anahtar soruların yanıtlatılabilir. Önceki protokoller bölgeler arasında ayrım yapmadan ko-amniyotik membrandan hücreleri izole ederken, protokolümüz üç farklı anatomik bölgeden izole edilmiş hücre popülasyonunun kültürünü sağlar. Bölgeye göre amniyotik membran ayırmak için, steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabine, göbek kordonu saran göbek amnion tanımlamak, decidua bazalis kapsayan plasental amnion, ve yansıyan bölge, plasenta bağlı olmayan amnion geri kalanı olarak kabul edilir.
Göbek amnion bölgesini incelemek için, plasenta ve göbek kordonu kavşağını kaplayan amnion zarının bir kısmını tutmak için diseksiyon terpler kullanın ve kordonu çevreleyen bölgeyi incelemek için neşter kullanın, bölgeyi kornden ayırmak için uzanırken. Daha sonra, tuzlu çözelti 100 mililitre ile etiketli bir beher ayrılmış doku mevduat. Plasental amnion bölgesini incelemek için, plasentayı kaplayan korrion/amnion yüzeyindeki kan pıhtılarını temizlemek için steril pamuklu gazlı bez kullanın.
Ve plasenta ve yansıyan bölge arasındaki sınırda membran kavramak için diseksiyon forceps kullanın. Plasenta çevresi boyunca kesmek ve plasenta herhangi bir damarları kesmek için dikkatli olmak, chorion plasenta amnion ayırmak için bir neşter kullanın. Ayrılmış dokuyu 300 mililitre tuzlu çözelti ile etiketlenmiş başka bir kabın içinde yerleştirin.
Ve plasentaya bağlı olmayan amniyotik zarın geri kalanını korriondan ayırın. Daha sonra, 300 mililitre tuzlu çözelti ile başka bir etiketli beher yansıyan bölge yerleştirin. Membranları yıkamak için, doku her konteyner tuzlu çözelti atmak edebilmek için steril bir yüzeye yerleştirmek için cımbız kullanın.
Membranları tekrar konteynere yerleştirin ve göbek bölgesine 100 mililitre taze tuzlu çözelti ve plasental ve yansıyan bölgelere 300 mililitre taze tuzlu çözelti ekleyin. Herhangi bir kan kalıntısı kaldırmak ve tuzlu çözeltileri atmak edebilmek için steril yüzeye membranlar yerleştirmek için membranlar karıştırmak için kesme forceps kullanın. Daha sonra, dokular yarı saydam olana kadar, sadece gösterildiği gibi, en az iki kez daha membranlar yıkayın.
Farklı amniyotik membran bölgelerinin enzimatik sindirimi için, yansıyan ve plasental bölgeleri iki veya üç parçaya ayırın. Ve parçaları ve göbek bölgesini tek tek 50 mililitrelik santrifüj tüplere yerleştirin. Yansıyan ve plasental bölge doku parçalarının her tüpüne %0,5 tripsin-EDTA 20 mililitre ve göbek bölgesi dokusunu içeren tüpe %0,5 tripsin-EDTA beş mililitre ekleyin.
Tüpleri 30 saniye hafifçe sallayın. Daha sonra membranları steril bir yüzeye yerleştirin, tripsin-EDTA çözeltisini atın ve umbilical bölge dokusu için yansıtılan ve plasental bölge doku parçaları için 30 mililitre taze %0,5 tripsin-EDTA ve 15 mililitre taze 0,5 tripsin-EDTA ile değiştirin. Daha sonra tüpleri bir kuvözün içine yerleştirin ve dakikada 20 dönüşte 37 santigrat derecede 40 dakikalık bir dönüş için.
Kuluçka sonunda, hücre çözeltisinin tüm hacmini yeni konik tüplere aktarın. Ve buzüzerindeki her tüpe 37 derecelik insan AE hücrelerinin iki kat daha fazla hacmini ekleyin. Taze% 0.5 tripsin-EDTA ile orijinal tüplerde kalan doku parçaları sindirmek, sadece gösterildiği gibi.
İkinci sindirim sonunda, amnion kısmının bir ucunu tutmak için bir çift diseksiyon forceps ve önceki kuluçka dönemlerinde tamamen soyulmamış epitel hücrelerinin herhangi bir satır kaldırmak için kalan doku boyunca sıkmak için diseksiyon forceps ikinci bir çift kullanın. Daha sonra, santrifüj tüpler ikinci bir dizi ikinci sindirim çözeltisi aktarmak mümkün olmak için membranlar çıkarın. Ve buz üzerinde taze 37 derecelik insan AE hücre ortamının iki katı hacmi ile sindirim enzimleri inaktive.
İnsan AE hücre izolasyonu için, santrifüj ile hücreleri tortu. Ve her tüpteki peleti 10 mililitre taze 37 derecelik insan AE hücre ortamıyla yeniden askıya alın. Tek bir tüp içine sindirim her çifti çekin ve herhangi bir ekstrahücre dışı matris enkaz kaldırmak için 100 mikrometre süzgeçler aracılığıyla süspansiyonlar filtre.
Sayma sonra, üç bölgenin her birinden insan AE hücrelerini üç kez 100 milimetrelik plakalara, santimetre cinsinden dördüncü hücrelere, 37 derecelik insan AE hücre ortamında, insan epidermal büyüme faktörünün mililitresine 10 nanogramla desteklenerek, santimetre karesi olan 4 000 metrelik plakalara yerleştirin. Daha sonra, ilgi downstream analizi kadar nemlendirilmiş bir kuvöz normoksik koşullar altında 37 santigrat derece kültürlerin kuluçka. 48 saatlik kültürden sonra, epitel fenotipli insan AE hücreleri plakanın yüzeyine yapışır, süpernatant ise ortam değiştirildikten sonra çıkarılabilen hücre enkazı ve yüzen hücreler içerir.
Bakteriyel kontaminasyonun, membranların yetersiz yıkanması nedeniyle aşırı eritrositlerin, eksik veya yapışmaz hücrelerin veya fibroblast morfolojisi olan hücrelerin varlığını tespit ettikten sonra kültürleri atmak ve başka bir membranı işlemek tavsiye edilir. İnsan AE hücre morfolojisi hücrelerin kökenine bağlıdır, yansıyan bölgeden hücreler bir küloidal morfoloji göstermek ve arnavut kaldırımlı bir monolayer büyümek gibi, ve plasental ve göbek bölgelerinden hücreler düz ve skuamöz. E-kadherine karşı immünofloresans, birincil kültürlerin ve alt kültürlerin epitel fenotiplerini koruduklarını ortaya çıkararak başka bir hücre tipinde kontaminasyon olmadığını düşündürmektedir.
Buna ek olarak, hücreler, Ki-67 proliferasyon belirteci onların ifade ile kanıtlanabilir. Amnion alt popülasyonları morfolojisi ve işlevleri açısından farklılık gösterirken, plasental ve yansıyan bölgelerden elde edilen insan AE hücrelerinde pluripotency faktörlerinin özünün ifadesi ve varlığı değişmez. İnsan amniyotik epitel hücreleri pluripotent kök hücrelerin olası bir kaynak olduğundan, her bölgeden bu hücrelerin farklı potansiyellere sahip olup olmadığını açıklamak için özel tanım protokolleri bir çizgi ile onlara meydan okuyabilirsiniz.
Daha önce başlatılan bir protokol, doku enfeksiyon hiçbir mikrobiyolojik özellikleri sergiler emin olmak için hastanın tıbbi geçmişini gözden geçirin.
