Dieses Protokoll kann helfen, wichtige Fragen über Heterogenität und funktionelle Eigenschaften menschlicher Fruchtieinerepithelzellen zu beantworten, die aus der Fruchtwassermembran isoliert sind. Während frühere Protokolle Zellen aus der ko-amniotischen Membran isolierten, ohne zwischen den Regionen zu unterscheiden, erlaubt unser Protokoll die Kultur der Zellpopulation, die aus drei verschiedenen anatomischen Regionen isoliert ist. Um die Fruchtwassermembran nach Region zu trennen, in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen, identifizieren Sie das Nabelam, das die Nabelschnur umhüllt, die Plazenta-Amnion, die die Decidua basalis bedeckt, und die reflektierte Region, die als der Rest des Amnions betrachtet wird, das nicht an der Plazenta befestigt ist.
Um die Nabelamnionregion zu sezieren, verwenden Sie Sezieren von Zangen, um den Teil der Amnionmembran zu halten, der die Kreuzung der Plazenta und der Nabelschnur bedeckt, und verwenden Sie ein Skalpell, um die Region zu sezieren, die die Schnur umgibt, während sie sich streckt, um den Bereich von der Chorion zu trennen. Dann legen Sie das getrennte Gewebe in einem markierten Becher mit 100 Milliliter naline Lösung ab. Um die Plazenta-Amnion-Region zu sezieren, verwenden Sie eine sterile Baumwollgaze, um die Blutgerinnsel von der Oberfläche des Chorions/Amnions zu entfernen, das die Plazenta bedeckt.
Und verwenden Sie sezierende Zangen, um die Membran an der Grenze zwischen der Plazenta und der reflektierten Region zu erfassen. Verwenden Sie ein Skalpell entlang des Umfangs der Plazenta zu schneiden und trennen Sie die Plazenta Amnion von der Chorion, achten Sie darauf, keine Gefäße aus der Plazenta zu schneiden. Legen Sie das abgetrennte Gewebe in einen anderen beschrifteten Becher mit 300 Milliliter neiner Salinelösung.
Und trennen Sie den Rest der Fruchtwassermembran, die nicht an der Plazenta befestigt ist, von der Chorion. Legen Sie dann die reflektierte Region in einen anderen beschrifteten Becher mit 300 Milliliter naline Lösung. Um die Membranen zu waschen, verwenden Sie eine Pinzette, um sie auf eine sterile Oberfläche zu legen, um die Saline-Lösung aus jedem Behälter mit Gewebe zu entsorgen.
Legen Sie die Membranen wieder in den Behälter und fügen Sie 100 Milliliter frische Salinelösung in die Nabelregion und 300 Milliliter frischer Salinelösung in die Plazenta- und reflektierten Regionen. Verwenden Sie Sezieren der Zangen, um die Membranen zu rühren, um alle Blutrückstände zu entfernen und legen Sie die Membranen auf die sterile Oberfläche, um die Saline-Lösungen zu entsorgen. Dann waschen Sie die Membranen mindestens zwei weitere Male, wie gerade gezeigt, bis das Gewebe durchscheinend ist.
Zur enzymatischen Verdauung der verschiedenen Fruchtwassermembranregionen die reflektierten und plazentten Regionen in zwei oder drei Fragmente schneiden. Und legen Sie die Fragmente und den Nabelbereich in einzelne 50-Milliliter-Zentrifugenröhren. Fügen Sie 20 Milliliter 0,5%Trypsin-EDTA zu jeder Röhre von reflektierten und plazentaförmigen Gewebefragmenten und fünf Milliliter 0,5%Trypsin-EDTA in die Röhre, die das Nabelbereichsgewebe enthält.
Schütteln Sie die Rohre 30 Sekunden lang sanft. Dann legen Sie die Membranen auf eine sterile Oberfläche, entsorgen Sie die Trypsin-EDTA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 30 Milliliter frische0,5%Trypsin-EDTA für die reflektierten und plazentaförmigen Gewebefragmente und 15 Milliliter frische0,5%Trypsin-EDTA für das Nabelbereichsgewebe. Legen Sie die Rohre dann in einem Rotator in einem Inkubator für eine 40-minütige Drehung bei 20 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius.
Übertragen Sie am Ende der Inkubation das gesamte Volumen der Zelllösung in neue konische Röhren. Und fügen Sie das Zweifache des Volumens von 37-Grad-Celsius menschlichen AE-Zellen medium zu jeder Röhre auf Eis hinzu. Verdauen Sie alle übrig gebliebenen Gewebefragmente in den Originalröhren mit frischen 0,5%Trypsin-EDTA, wie gerade gezeigt.
Verwenden Sie am Ende der zweiten Verdauung ein Paar sezierender Zangen, um ein Ende des Amnion-Anteils zu halten, und ein zweites Paar sezierender Zangen, um entlang des verbleibenden Gewebes zu quetschen, um alle Reihen von Epithelzellen zu entfernen, die sich während der vorherigen Inkubationsperioden nicht vollständig abblätterten. Entfernen Sie dann die Membranen, um die zweite Verdauungslösung auf einen zweiten Satz Zentrifugenrohre übertragen zu können. Und inaktivieren Sie die Verdauungsenzyme mit dem zweifachen Volumen des frischen 37-Grad-Celsius-Human-AE-Zellmediums auf Eis.
Für die Isolierung menschlicher AE-Zellen, SedimentdieZellen durch Zentrifugation. Und setzen Sie das Pellet in jedem Rohr mit 10 Milliliter frisches 37-Grad-Celsius menschliches AE-Zellmedium wieder auf. Ziehen Sie jedes Paar Verdauungsteile in ein einziges Rohr und filtern Sie die Suspensionen durch 100-Mikrometer-Siebe, um extrazelluläre Matrix-Trümmer zu entfernen.
Nach dem Zählen säen Sie die menschlichen AE-Zellen aus jeder der drei Regionen in einzelne 100-Millimeter-Platten mit einer dreimal 10 bis vierten Zelle pro Zentimeter quadratischer Konzentration in 37-Grad-Celsius-Human-AE-Zellmedium, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktors. Dann inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter normoxischen Bedingungen in einem befeuchteten Inkubator bis zur nachgelagerten Analyse des Interesses. Nach 48 Stunden Kultur haften menschliche AE-Zellen mit einem epitheliale phänotypischen Anhaftungsfraktions, während der Überstand Zellablagerungen und schwimmende Zellen enthält, die entfernt werden können, sobald das Medium gewechselt wird.
Es ist ratsam, die Kulturen zu verwerfen und eine andere Membran zu verarbeiten, wenn das Vorhandensein von bakteriellen Kontaminationen, übermäßigen Erythrozyten aufgrund unzureichender Waschen der Membranen, mangelhaftoder nicht haftende Zellen oder Zellen mit einer Fibroblastenmorphologie identifiziert wird. Die Morphologie menschlicher AE-Zellen hängt vom Ursprung der Zellen ab, da Zellen aus der reflektierten Zone eine quakotale Morphologie zeigen und in einer gepflasterten Monoschicht wachsen, und Zellen aus den Plazenta- und Nabelregionen flacher und plattenförmiger sind. Die Immunfluoreszenz gegen E-Cadherin zeigt, dass die Primärkulturen und Subkulturen ihren epitheliale Phänotyp beibehalten, was darauf hindeutet, dass es keine Kontamination eines anderen Zelltyps gibt.
Darüber hinaus sind die Zellen lebensfähig, wie ihre Expression des Ki-67 Proliferationsmarkers belegt. Obwohl sich die Subpopulationen aus dem Amnion in ihrer Morphologie und Funktion unterscheiden, ändert sich der Ausdruck und die Präsenz des Kerns der Pluripotenzfaktoren in menschlichen AE-Zellen, die aus der Plazenta und reflektierten Regionen abgeleitet sind, nicht. Da menschliche Fruchtiozienepithelzellen eine mögliche Quelle pluripotenter Stammzellen sind, können wir sie durch eine Reihe spezifischer Definitionsprotokolle herausfordern, um zu klären, ob diese Zellen aus jeder Region unterschiedliche Potenziale haben.
Überprüfen Sie vor einem begonnenen Protokoll die Krankengeschichte des Patienten, um sicherzustellen, dass das Gewebe keine mikrobiologischen Merkmale einer Infektion aufweist.
