이 프로토콜은 양수 막에서 분리된 인간 양수 상피 세포의 이질성 및 기능적 특성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전 프로토콜은 지역 간의 안목없이 공동 양수 막에서 세포를 격리하는 동안, 우리의 프로토콜은 세 가지 별개의 해부학 적 영역에서 분리 된 세포 집단의 배양을 허용합니다. 양막을 지역별로 분리하기 위해, 멸균 조건하에서 생물안전 성 캐비닛에서, 탯줄을 감싸는 탯줄, 데시두아 기저증을 덮는 태반 양막 및 태반에 부착되지 않은 양막의 나머지 부분으로 간주되는 반사 부위를 식별한다.
배꼽 양막 영역을 해부하려면 해부 된 집게를 사용하여 태반과 탯줄의 접합을 덮는 양막의 일부를 잡고 메스를 사용하여 코드를 둘러싼 영역을 해부하면서 영역을 초리온에서 분리하십시오. 그런 다음, 염수 용액의 100 밀리리터로 라벨이 붙은 비커에 분리 된 조직을 증착합니다. 태반 양막 부위를 해부하려면 멸균 면 거즈를 사용하여 태반을 덮는 초리온 /양막 표면에서 혈전을 제거하십시오.
그리고 해부 집게를 사용하여 태반과 반사 된 영역 사이의 경계의 멤브레인을 파악합니다. 태반의 둘레를 따라 잘라 태반 의 둘레를 따라 절단하고 태반 양막에서 태반 양언을 분리하는 메스를 사용하여 태반에서 어떤 혈관을 절단하지 않도록주의하십시오. 분리된 조직을 다른 라벨이 붙은 비커에 300밀리리터의 식염수 용액을 배치합니다.
그리고 태반에 부착되지 않은 양수막의 나머지 부분을 초리온으로부터 분리한다. 그런 다음 반사된 영역을 300밀리리터의 식염수 용액으로 다른 라벨이 붙은 비커에 배치합니다. 멤브레인을 세척하려면 핀셋을 사용하여 멸균 표면에 배치하여 조직의 각 용기에서 식염수 용액을 버릴 수 있습니다.
멤브레인을 용기에 다시 넣고 배꼽 부위에 100 밀리리터의 신선한 식염수와 300 밀리리터의 신선한 식염수 용액을 태반 및 반사 된 영역에 추가합니다. 해부 포셉을 사용하여 막을 교반하여 혈액 잔류물을 제거하고 멸균 표면에 멤브레인을 배치하여 식염수 용액을 버릴 수 있습니다. 그런 다음 조직이 반투명 할 때까지 방금 설명 한 대로 멤브레인을 적어도 두 번 더 씻으십하십시오.
다른 양수 막 영역의 효소 소화를 위해 반사된 태반 부위를 2개 또는 3개의 조각으로 자릅니다. 그리고 파편과 탯줄을 개별 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 배치합니다. 20 밀리리터0.5%의 트립신-EDTA를 각 튜브에 반사 및 태반 부위 조직 단편과 배꼽 영역 조직을 포함하는 튜브에 0.5%의 트립신-EDTA 5밀리리터를 첨가한다.
튜브를 30초 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 멤브레인을 멸균 표면에 놓고 트립신-EDTA 용액을 버리고 반사 및 태반 부위 조직 단편에 대한 신선한 0.5 %의 트립신-EDTA의 30 밀리리터와 배꼽 조직 부위에 대한 신선한 0.5 %의 트립신-EDTA15 밀리리터로 대체하십시오. 그런 다음 튜브를 인큐베이터 내부에 회전기에 넣고 섭씨 37도에서 분당 20 회전에서 40 분 회전합니다.
인큐베이션이 끝나면 전체 셀 용액을 새로운 원문 튜브로 옮기습니다. 그리고 얼음에 각 튜브에 37도-섭씨 인간 AE 세포의 두 배를 추가합니다. 원래 튜브의 남은 조직 조각을 신선한 0.5%의 트립신-EDTA로 소화합니다.
두 번째 소화의 끝에서, 양막 부분의 한쪽 끝을 보유하기 위해 해부 집게의 쌍을 사용하고 이전 잠복 기간 동안 완전히 벗겨지지 않은 상피 세포의 행을 제거하기 위해 나머지 조직을 따라 짜내기 위해 양해 봉면의 두 번째 쌍을 사용합니다. 그런 다음 두 번째 소화 용액을 두 번째 원심분리관 세트로 이송할 수 있도록 멤브레인을 제거합니다. 그리고 얼음에 신선한 37도 -섭씨 인간 AE 세포 매체의 두 배의 부피와 소화 효소를 비활성화.
인간 AE 세포 절연을 위해, 원심분리에 의한 세포를 퇴적시한다. 그리고 신선한 37도-섭씨 인간 AE 세포 배지의 10 밀리리터로 각 튜브에 펠릿을 다시 놓아. 각 소화기를 단일 튜브로 당기고 100 마이크로미터 스트레이너를 통해 서스펜션을 필터링하여 세포외 매트릭스 이물질을 제거합니다.
카운트 후, 인간 AE 세포를 3배 100밀리미터 플레이트로 3배 10내지 제4세포로 37도-섭씨 인간 AE 세포 배지로, 인간 표피 성장 인자의 밀리리터당 10나노그램으로 보충하였다. 그런 다음, 관심의 다운스트림 분석까지 가습 인큐베이터에서 노목 조건에서 섭씨 37도에서 배양. 48시간의 배양 후, 상피 표현형을 가진 인간 AE 세포는 플레이트의 표면에 부착되고, 수퍼네이트에는 배지가 변경되면 제거할 수 있는 세포 파편과 부동 세포가 포함되어 있다.
배양을 버리고 세균 오염의 존재를 식별할 때 다른 막을 처리하고, 막의 세척이 부족하거나, 부족하거나 비부착적인 세포 또는 섬유아세포 형태를 가진 세포로 인한 과도한 적혈구를 처리하는 것이 좋습니다. 인간 AE 세포 형태는 반사 된 영역에서 세포가 입체 형태를 입증하고 자갈 단층에서 성장하고, 태반 및 배꼽 영역에서 세포가 아첨과 편평상피이기 때문에 세포의 기원에 따라 달라집니다. E-cadherin에 대한 면역 형광은 1 차 배양과 하위 배양이 상피 표현형을 유지한다는 것을 밝혀, 다른 세포 유형의 오염이 없다는 것을 시사.
또한, 세포는 Ki-67 증식 마커의 발현에 의해 입증된 바와 같이 실행 가능하다. 양막에서 하위 인구는 그들의 형태와 기능에 다르지만, 흉부 요인의 핵심의 발현 그리고 존재는 태반 및 반사 된 지역에서 파생된 인간 AE 세포에서 변경되지 않습니다. 인간 양수 상피 세포는 다능성 줄기 세포의 가능한 근원이기 때문에, 우리는 각 지역에서 이 세포가 다른 잠재력을 가지고 있는지 를 해명하기 위하여 특정 정의 프로토콜의 줄을 통해 그(것)들을 도전할 수 있습니다.
개시된 프로토콜에 앞서, 조직의 감염의 미생물 특성을 나타내지 않도록 환자의 병력을 검토한다.
