3D multicolor DNA FISH permite la visualización de múltiples loci genómicos dentro de núcleos conservados para definir ambiguamente su interacción recíproca y localización a nivel de una sola célula. 3D multicolor DNA FISH permite la investigación directa de la arquitectura nuclear. En general, funciona en conjunto con tecnologías basadas en la captura de cromosomas, lo que convierte a la técnica en una herramienta disponible para la validación de datos C dentro de celdas individuales.
Demostrando el procedimiento estará Federica Marasca. Es posdoctora en mi laboratorio. Comience incubando la mezcla de traducción de nick en un mezclador térmico a 16 grados Celsius de acuerdo con la longitud del material de ADN inicial.
Al final de la incubación, compruebe el tamaño de las sondas en un gel de agarosa del 2,2%. Para cada experimento DNA FISH, precipitar la cantidad adecuada de sonda de acuerdo con el material de ADN de partida a partir del cual se produjeron las sondas en 150 microlitros de agua doble destilada, 20 microgramos de ADN esperma de salmón sin etiquetar, 3,5 microgramos de ADN Cot-1 específico de la especie, tres volúmenes de 100% de etanol y un volumen de 1/10 de tres molares de acetato de sodio durante una hora a menos 80 grados Centígrados. Al final de la incubación, centrifuga la muestra a velocidad máxima durante una hora a cuatro grados centígrados.
Después de desechar el sobrenadante, lave el pellet dos veces con 500 microlitros de 70%etanol. Después del segundo lavado, resuspender el pellet en dos microlitros de 100%formamida y agitar la sonda durante 30 minutos a 40 grados Celsius antes de agregar un volumen igual de citrato de sodio salino 4X en sulfato de 20%dextrano. Para el pretratamiento de fijación y permeabilización de células pequeñas con núcleos pequeños y una baja cantidad de citoplasma, primero agregue dos veces 10 a las sextas células en 200 microlitros de PBS directamente sobre cubiertas de vidriolips en pozos individuales de una placa de 24 pozos y permita que las células se asienten durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, reemplace rápidamente el PBS por 300 microlitros de 4%paraformaldehído recién preparado complementado con 0.1%Tween 20. Después de 10 minutos, lave las células fijas tres veces en 300 microlitros de 0.05%TPBS durante cinco minutos por lavado a temperatura ambiente. Después del último lavado, permeabilizar las células T con 300 microlitros de 0.5%TPBS durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de tratar las células con 250 microlitros por pozo de cóctel RNAse diluido 1:100 en PBS durante una hora a 37 grados Celsius.
Al final de la incubación, enjuague las células en 300 microlitros de PBS y agregue 300 microlitros de 20% de glicerol en PBS a cada pozo con una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, coloque el vaso sobre hielo seco durante 15 a 30 segundos para congelar las células antes de descongelar gradualmente las muestras a temperatura ambiente y remojarlas en 300 microlitros de 20% de glicerol en PBS durante 30 segundos. Después de congelar/descongelar las células tres veces más como se acaba de demostrar, lave las muestras en 300 microlitros de 0,5%TPBS durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguidos de dos lavados en 300 microlitros de 0,05%TPBS durante cinco minutos por lavado a temperatura ambiente.
Después del último lavado, tratar las células con 300 microlitros de ácido clorhídrico normal 0,1 durante 12 minutos a temperatura ambiente, seguidos de dos enjuagues en 300 microlitros de citrato de sodio salino. A continuación, fije las muestras durante la noche en 300 microlitros de 50% de formamida en citrato de sodio salino 2X a temperatura ambiente. Para la fijación, pretratamiento y permeabilización de células grandes con una alta cantidad de citoplasma, fijar, pretratar y permeabilizar las células de forma similar a como se demostró para las células T primarias humanas y tratar las muestras con 300 microlitros de 0.0025%pepsin en 0.01 ácido clorhídrico normal durante unos segundos hasta cinco minutos.
Observar las células bajo un microscopio óptico y detener la reacción con dos lavados de cinco minutos en 300 microlitros de cloruro de magnesio 50 mililitros tan pronto como los núcleos estén libres del citoplasma, pero los nucleoli siguen siendo visibles e intactos. Para el ADN multicolor 3D FISH, desnaturaliza las sondas de hibridación a 80 grados Celsius durante cinco minutos e inmediatamente coloca las sondas sobre hielo. Cargue las sondas en una diapositiva de microscopio limpia y coloque una cubierta de células en cada gota de sonda.
Selle los bordes de los cubreobjetos con cemento de goma. Cuando el cemento se haya secado por completo, desnaturaliza las muestras en un bloque de calentamiento de 75 grados Celsius. Después de cuatro minutos, hidrata las muestras a 37 grados centígrados durante la noche en una caja metálica flotando en un baño de agua.
A la mañana siguiente, despegue el cemento de goma y con los portaobjetos sumergidos en citrato de sodio salino 2X levante cuidadosamente los cubreobjetos. Coloque cada cubreobjetos en pozos individuales de una placa de seis pozos que contenga dos mililitros de citrato de sodio salino fresco por pozo para dos lavados de cinco minutos a 37 grados centígrados con temblores a 90 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, enjuague brevemente los cubreobjetos en dos mililitros de 0,2%Tween 20 en citrato de sodio salino 4X.
Para la detección de ADN DE ADN multicolor 3D, transfiera los cubreobjetos a pozos individuales de una nueva placa de 24 pozos y bloquee cualquier unión no específica en 300 microlitros de búfer de bloqueo durante 20 minutos a 37 grados Celsius y 20 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, tratar las muestras con la concentración adecuada de anti-digoxigenina y/o estreptavidina diluida en tampón de bloqueo durante 35 minutos en una cámara oscura y húmeda a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, transfiera las muestras a pozos individuales de una placa de seis pocillos y lave las muestras tres veces en dos mililitros de citrato de sodio salino de 0,2% y 4X de citrato de sodio salino durante cinco minutos por lavado con agitación a 90 revoluciones por minuto.
Después del último lavado, equilibre las muestras en dos mililitros de PBS antes de transferir los cubreobjetos a una nueva placa de 24 pozos para la post-fijación en 300 microlitros de 2% formaldehído en PBS por pozo durante dos minutos a temperatura ambiente. Lavar las células fijas cinco veces brevemente en 300 microlitros de PBS, seguido de tinción con DAPI diluido a un nanograto por mililitro en 300 microlitros de PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lave los cubreobjetos cinco veces más en PBS y monte las muestras con un medio de montaje adecuado.
A continuación, adquiera imágenes 3D con un sistema de microscopio. 3D multicolor DNA FISH permite la visualización contemporánea de diferentes loci genómicos dentro de núcleos 3D conservados. Para la preparación de la sonda de ADN, un tamaño de sonda de menos de 200 pares base garantiza un procedimiento exitoso de ADN DE ADN multicolor 3D.
Las sondas FISH de ADN subóptimo producidas por la traducción de nicks pueden ser parcialmente o sobre digeridas. Las sondas digeridas en exceso darán lugar a una señal inespecífica debido a una pérdida de especificidad en la hibridación y un aumento consecuente del fondo. Para los linfocitos T primarios humanos y las células pequeñas con núcleos pequeños y una baja cantidad de citoplasma, se recomienda un tratamiento normal de ácido clorhídrico de 12 minutos y 0,1 para promover la accesibilidad de los núcleos a las sondas de ADN y preservar la integridad nuclear.
La digestión de la pepsina citoplasma no es necesaria para obtener una buena señal de ADN FISH en células pequeñas. Para los mioblastos primarios humanos y las células que tienen núcleos grandes y citoplasma abundante, sin embargo, el paso de pepsinización es fundamental. Una pepsinización de citoesqueleto corta y subóptima obstaculizará la entrada de la sonda en los núcleos que terminan en ausencia de una señal FISH de ADN.
Sin embargo, si las células están sobre pepsinizadas, los núcleos no permanecerán intactos perdiendo su estructura 3D. Un ADN multicolor 3D exitoso FISH dará lugar a la presencia de señal dentro de los núcleos. Sugiero trabajar con material biológico fresco, probar sondas antes de realizar el ADN multicolor 3D FISH, preparar soluciones frescas y ser precisos con los tiempos de incubación y las temperaturas.
Recuerde que formamida y HCL son sustancias peligrosas y siempre deben utilizarse en una campana química con materiales desechables adecuados.
