Agradecemos la asistencia científica y técnica del INGM Imaging Facility, en particular, C. Cordiglieri y A. Fasciani, y de la instalación de clasificación INGM FACS en particular M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM), Milán, Italia). Agradecemos al Sr. Giannaccari por su apoyo técnico informático. Este trabajo fue financiado por las siguientes subvenciones: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, subvención n.º 2018-0321) y Fondazione AIRC (subvención n.º MFAG 29165) a F.M. Ricerca Finalizzata, (subvención n.º GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (subvención n.º 2022 27066), Fondazione Cariplo (subvención n.º 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018), Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (subvención n.º G43C22002620007) y Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (subvención n.º 2022PKF9S) a B. B.

El uso de muestras humanas con fines de investigación fue aprobado por los Comités de Ética de la Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milán), y se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos (número de autorización: 708_2020). El protocolo se organiza en tres secciones principales: ejecución de inmunofluorescencia, adquisición de imágenes y análisis de imágenes. En promedio, requiere 4 días hábiles para completarse (Figura 1).
1. Preparación de inmunofluorescencia
NOTA: Este protocolo de inmunofluorescencia se puede personalizar fácilmente para varios tipos de células y objetivos proteicos ajustando las condiciones de fijación y permeabilización. La preparación de la inmunofluorescencia suele tardar menos de 3 días en completarse, y la duración de la incubación primaria de los anticuerpos varía en función de la calidad del anticuerpo y de la proteína diana (Figura 1).
<ol><li>Preparación de la muestra<ol><li>Aislar células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mediante una centrifugación en gradiente de densidad a través de un medio de aproximadamente 1,077 g/mL de densidad según las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).</li>
		<li>Aísle las células T CD4+ de las PBMC con perlas magnéticas, siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de Materiales).</li>
		<li>Teñir las células con anticuerpos para CD4, CD45RA y CD45RO (Tabla de materiales) y proceder a la clasificación FACS de las células T CD4+ vírgenes como células CD4+/CD45RA+/CD45RO-, como se describe en otra parte29,30. NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para conocer las especificaciones del clasificador FACS utilizado en este protocolo.</li>
		<li>Inducir la diferenciación de linfocitos T CD4+ vírgenes vírgenes en linfocitos T helper 1 (linfocitos TH1 CD4+ ) como se describe en el punto 29. En resumen, cultive 1,5 x 106 células/ml de células T CD4+ vírgenes clasificadas por FACS en medio TH1 estimulándolas con perlas magnéticas anti-CD3/anti-CD28 en una proporción de 1:1. Cuente las células y divídalas cuando alcancen 1,5 × 106 células/ml cada 2-3 días (ver Tabla 1 para la composición del medio TH1).</li>
		<li>Evaluar la secreción de citocinas de la función efectora después de 7 días de diferenciación, como se describe en 29.</li>
	</ol></li>
	<li>Fijación y permeabilización celular NOTA: Todos estos procedimientos se describieron en 30,31 con pequeñas adaptaciones.<ol><li>Para garantizar una adhesión celular óptima, trate los cubreobjetos de vidrio (10 mm, espesor 1,5 H) con una solución de recubrimiento (Tabla 1) de la siguiente manera:<ol><li>Limpie los cubreobjetos de vidrio lavándolos inicialmente con agua destilada (ddH2O), seguido de un enjuague con etanol al 70% (EtOH), y dejándolos secar al aire.</li>
			<li>Coloque los cubreobjetos lavados en una placa de 24 pocillos múltiples para los pasos 1.2.1.3-1.3.</li>
			<li>Aplique una gota de 200 μL de solución de recubrimiento sobre el cubreobjetos de vidrio. Después de 5 minutos, retira la gota y déjala secar al aire.</li>
			<li>Lavar los cubreobjetos aplicando una gota de 200 μL de ddH2O. Después de 5 minutos, retire la gota y seque al aire.</li>
			<li>Repita 3 pasos 1.2.1.3-1.2.1.4.</li>
		</ol></li>
		<li>Resuspenda las células T CD4+ naïve y las células TH1 CD4+ en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x a una concentración de 2 × 106 células/mL. NOTA: La concentración indicada se recomienda específicamente para células pequeñas, como los linfocitos T primarios humanos. Para las células adherentes, no es necesario el tratamiento de recubrimiento de vidrio. En su lugar, proceda directamente con el cultivo de las células en la superficie del vidrio utilizando el medio de cultivo celular adecuado.</li>
		<li>Aplique una gota de 200 μL de la suspensión celular sobre el cubreobjetos de vidrio. Deje que las células se siembren a temperatura ambiente (RT) durante 30 min; A continuación, retira la gota.</li>
		<li>Fije las células con paraformaldehído al 3% recién filtrado (solución de PFA, Tabla 1) durante 10 min en RT.</li>
		<li>Lave el cubreobjetos de vidrio con TPBS (Tabla 1) durante 3 x 5 min en RT.</li>
		<li>Retire el TPBS y agregue la solución de permeabilización (Tabla 1) durante 10 min en RT.</li>
		<li>Deseche la solución de permeabilización e incube la muestra en una solución de almacenamiento (Tabla 1) desde 1 h hasta toda la noche (ON) a 4 °C. NOTA: En esta etapa, el protocolo se puede detener de manera segura y los cubreobjetos de vidrio se pueden conservar en solución de almacenamiento en una placa de 24 pocillos múltiples durante 3-4 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunofluorescencia<ol><li>(Opcional) Retire el cubreobjetos de la placa de 24 pocillos múltiples y congele rápidamente en hielo seco durante 30 s, descongele a RT y luego lave el cubreobjetos de vidrio en un pocillo prellenado con solución de almacenamiento.</li>
		<li>(Opcional) Repita 3 x paso 1.3.1.</li>
		<li>Lavar en solución de permeabilización durante 5 min en RT. A continuación, lavar durante 2 x 5 min con TPBS en RT.</li>
		<li>Incubar en HCl de 0,1 N durante 12 min en RT.</li>
		<li>Realiza dos lavados rápidos en 1x PBS. NOTA: Las condiciones de permeabilización celular especificadas, incluidos los pasos de congelación y descongelación y el tratamiento con HCl, son óptimas para teñir componentes nucleares en células caracterizadas por cromatina densamente empaquetada. Sin embargo, cuando se trata de células caracterizadas por una cromatina menos compactada, es aconsejable reducir o evitar estos pasos. Además, para dirigirse a los componentes citoplasmáticos, considere reducir o eliminar el tratamiento con HCl.</li>
		<li>Incubar las células con el anticuerpo primario (BRD4, 1:500 o SUZ12, 1:100) diluido en tampón de dilución de anticuerpos (Tabla 1) (200 μL por cada cubreobjetos de vidrio) ON a 4 °C. NOTA: La inmunofluorescencia se puede realizar mediante la multiplexación de más de un anticuerpo primario dependiendo de las necesidades experimentales, los anticuerpos secundarios y los sistemas de detección.</li>
		<li>Lavar 3 x 5 min con PBS-T (Tabla 1) a RT con agitación suave.</li>
		<li>Incubar las células con anticuerpo secundario diluido en tampón de dilución de anticuerpos (200 μL por cada cubreobjetos de vidrio) durante 1 h a RT. NOTA: Elegir el anticuerpo secundario que mejor se adapte a las necesidades experimentales y a los sistemas de detección disponibles. Asegúrese de que cada anticuerpo secundario se dirija a la especie de la que se deriva el anticuerpo primario. Además, seleccione fluoróforos que sean compatibles con los filtros y la fuente de luz del microscopio. Es crucial evitar la superposición espectral entre el fluoróforo elegido y el espectro de emisión de la mancha nuclear.</li>
		<li>Lavar 3 x 5 min con PBS-T en RT con una leve agitación.</li>
		<li>Tinción con 1 ng/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluido en 1x PBS durante 5 min a RT. NOTA: Se pueden utilizar colorantes alternativos para la tinción nuclear siempre que no coincidan con el espectro de emisión de los anticuerpos secundarios.</li>
		<li>Realiza varios lavados rápidos en 1x PBS.</li>
		<li>Monte el cubreobjetos de vidrio en un portaobjetos de microscopía con medios de montaje antidecoloración.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Adquisición de imágenes
NOTA: La duración de la adquisición de la imagen depende del instrumento y de los ajustes seleccionados.
<ol><li>Adquisición de microscopio confocal<ol><li>Capture imágenes 3D con un microscopio confocal, estableciendo un tamaño de paso de 0,25 μm en z y un tamaño de píxel de 0,1-0,2 μm. NOTA: Para lograr una resolución óptima de difracción de luz limitada con nuestro objetivo de aceite de 1,4 NA de 63x, establecemos el tamaño del agujero de alfiler en 0,8 UA, un promedio de línea de 2x y un tamaño de fotograma de 1024 × 1024 píxeles. El láser de excitación, así como la secuencia de adquisición de canales, se seleccionaron deliberadamente para evitar interferencias o diafonías entre los fluoróforos utilizados. Sin embargo, el ajuste de los parámetros debe adaptarse a las características específicas del microscopio y de la muestra. Consulte la Tabla de materiales para conocer las especificaciones del microscopio confocal utilizado en este protocolo.</li>
		<li>Adquiera un número constante de campos aleatorios para abarcar aproximadamente 50 células por réplica biológica.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis de imágenes
<ol><li>Instalación de software<ol><li>Descargue e instale la última versión disponible de Fiji desde la página oficial de descargas de Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).</li>
		<li>Instale 3D Suite a través del sitio de actualización de Fiji o manualmente siguiendo las instrucciones en el sitio web de 3D Suite (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).</li>
		<li>Instale GDSC (FindFoci) a través del sitio de actualización de Fiji o manualmente siguiendo las instrucciones en el repositorio de GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).</li>
	</ol></li>
	<li>Conversión TIFF<ol><li>Descargue el script "convert_to_TIFF.py" (Archivo complementario 1).</li>
		<li>Arrastre y suelte el script en Fiji y ejecute el código.</li>
		<li>En el panel que aparece, vaya a la ruta de acceso en la que se almacena el experimento. La subcarpeta que contiene los archivos TIFF convertidos se crea en la misma carpeta del experimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Inicialice la configuración en 3D Manager.<ol><li>Abra el panel de opciones del Administrador 3D haciendo clic en Complementos | 3DSuite | Opciones del Administrador 3D.</li>
		<li>Dentro de la ventana de opciones del Administrador 3D, seleccione las casillas de verificación correspondientes a las siguientes mediciones: Volumen (unidad), Valor medio de gris, Cuadro delimitador (pix), Valor de gris estándar de desarrollo, Centroide (pix) y Centroide (unidad).</li>
		<li>Marque las siguientes opciones: Excluir objetos en los bordes XY y Excluir objetos en los bordes Z y haga clic en Aceptar. NOTA: Este paso debe realizarse solo una vez para configurar inicialmente las métricas que se almacenarán en los archivos de información espacial y cuantitativa. Las métricas seleccionadas son esenciales para garantizar el correcto funcionamiento de la canalización. Se pueden incluir métricas adicionales opcionales en este paso, como se describe con más detalle en la sección Discusión.</li>
	</ol></li>
	<li>Establezca los parámetros en la GUI de FindFoci. NOTA: Este paso debe realizarse solo una vez para configurar la tubería semiautomatizada con parámetros óptimos, que luego se incorporarán a los scripts.<ol><li>Abra la imagen de prueba. Duplique el canal de proteína, incluida la pila (Ctrl + Shift + D), marque la casilla de verificación hyperstack y especifique el número de canal adecuado dentro del cuadro Canales (c) y cámbiele el nombre en consecuencia.</li>
		<li>Inicie la grabadora de macros Fiji navegando a Complementos | Macros | Grabar.</li>
		<li>Abra el complemento FindFoci (haga clic en Complementos | GDSC | FindFoci | FindFoci GUI) y seleccione la imagen a analizar en el menú desplegable "Imagen".</li>
		<li>Configure los parámetros de la siguiente manera (Figura 2A): Desenfoque gaussiano = 1,5; método de fondo = DE por encima de la media; parámetro de fondo = 9; método de búsqueda = fracción de pico - fondo; parámetro de búsqueda = 0,7; método de pico = relativo por encima del fondo; parámetro de pico = 0,2; tamaño mínimo = 5; Picos máximos = 1.000.000. NOTA: Los parámetros indicados se han seleccionado en base a nuestros estudios de casos y pueden no ser adecuados para otros procedimientos de tinción.</li>
		<li>Para mejorar la identificación de focos, ajuste los siguientes parámetros:<ol><li>El desenfoque gaussiano define el grado de suavizado para mejorar los focos de los segmentos. Manténgalo cerca del diámetro de los focos (píxel).</li>
			<li>El parámetro de fondo establece un umbral para distinguir la señal de fondo de la señal de foco. Aumente los valores para imponer umbrales más estrictos.</li>
			<li>El parámetro de búsqueda define el porcentaje de fluorescencia del pico que se incluye en el reconocimiento de señales. Disminuya los valores para incluir áreas más alejadas del pico de fluorescencia.</li>
			<li>El parámetro de pico determina el grado en que dos picos de señal se consideran continuos o separados. La disminución del valor dará como resultado la separación de picos.</li>
			<li>Picos máximos especifica el número máximo de focos identificables. Establezca números altos para incluir todos los focos de la imagen.</li>
		</ol></li>
		<li>Ejecute FindFoci y copie la cadena que aparece en la ventana de la grabadora (Paso 3.4.2, Figura 2B) que contiene los parámetros seleccionados, excluyendo las comillas. Para obtener más información relacionada con la configuración, consulte las instrucciones del manual del complemento 22.</li>
	</ol></li>
	<li>Línea de cuantificación de proteínas nucleares<ol><li>Descargue el script "nuclear_prot_q.py" (Archivo Complementario 2).</li>
		<li>Arrastre y suelte el script en Fiji y haga clic en ejecutar para ejecutar el código.</li>
		<li>Siga las instrucciones del cuadro de diálogo que se muestra para procesar las imágenes.<ol><li>Canal del núcleo: introduzca el número correspondiente al canal de DAPI (o cualquier tinción nuclear).</li>
			<li>Desenfoque gaussiano del núcleo: introduzca el valor de sigma necesario para desenfocar la imagen para la segmentación. NOTA: Mantenga este parámetro más cerca del diámetro del núcleo (es decir, 5-6 μm). Los valores más altos de sigma están indicados para tinciones no homogéneas.</li>
			<li>Canal de proteína: introduzca el número correspondiente al canal de la tinción de interés.</li>
			<li>Parámetro FindFoci: pega la cadena obtenida del paso de grabación de macros en el pasaje 3.4.6 (Figura 2B).</li>
			<li>(Opcional) Control de calidad: comprobar la calidad de los núcleos segmentados. Esto pausará el script y permitirá la verificación manual de cada región nuclear de interés (ROI) generada.</li>
			<li>Seleccione un directorio de imágenes: haga clic en el botón Examinar para navegar a la carpeta que contiene los archivos TIFF que se van a analizar.</li>
		</ol></li>
		<li>Una vez que se hayan compilado todos los cuadros, haga clic en Aceptar para continuar con la ejecución.</li>
		<li>Si un núcleo no está correctamente segmentado y no cumple con los requisitos de calidad, elimínelo o modifíquelo como se indica en la Figura 2C.<ol><li>Compruebe la lista de ROI en la ventana ROIManager3D; si la lista está vacía, seleccione la ventana Combinar y haga clic en Cuantificar 3D para actualizar el administrador. A continuación, cierre la tabla de resultados de Cuantificar 3D. Seleccione el canal de los núcleos y haga clic en Live-ROI para ON.</li>
			<li>Seleccione el ROI que pertenezca al mismo núcleo y presione Fusionar o presione Eliminar en el caso de núcleos no deseados.</li>
			<li>Haga clic en Seleccionar todo y continúe con el análisis haciendo clic en Aceptar en la ventana de comprobación de máscara .</li>
			<li>Para obtener resultados, busque en la carpeta Cuantificación dentro de la ruta del archivo indicada en el paso 3.5.3.6, que contiene un archivo txt con registros del parámetro utilizado para el análisis.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Canalización en Google Colab<ol><li>Descargue el cuaderno "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (Archivo complementario 3).</li>
		<li>Abra el bloc de notas en Google Colab (https://colab.research.google.com/).</li>
		<li>Cargue todas las carpetas que contienen los archivos .csv de cada campo de imagen en una carpeta de preferencias en Google Drive.</li>
		<li>Indique en el cuaderno la ruta de la carpeta donde se almacenan las subcarpetas de resultados y ejecute todas las celdas. Cuando el código ha terminado de compilarse, el archivo final de la hoja de cálculo que contiene todos los datos compilados se crea en la misma carpeta donde se cargaron los archivos .csv.</li>
	</ol></li>
</ol>

Flujo de trabajo de análisis de la tinción de proteínas nucleares en células primarias humanas

<ol>
	<li>Aboelnour, E., Bonev, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+organization,+dynamics,+and+function+of+the+4D+genome.">Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome.</a> Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).</li><li>Erdel, F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+chromatin+subcompartments+by+phase+separation.">Formation of chromatin subcompartments by phase separation.</a> Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).</li><li>Henninger, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+feedback+control+of+transcriptional+condensates.">RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates.</a> Cell. 184 (1), 207-225 (2021).</li><li>Guo, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pol+II+phosphorylation+regulates+a+switch+between+transcriptional+and+splicing+condensates.">Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates.</a> Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).</li><li>Bhat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+genome+organization+around+nuclear+speckles+drives+mRNA+splicing+efficiency.">3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Spector, D. L., Lamond, A. 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M., Hoffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindFoci:+a+focus+detection+algorithm+with+automated+parameter+training+that+closely+matches+human+assignments,+reduces+human+inconsistencies+and+increases+speed+of+analysis.">FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis.</a> PLoS One. 9 (12), e114749 (2014).</li><li>Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TANGO:+a+generic+tool+for+high-throughput+3D+image+analysis+for+studying+nuclear+organization.">TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization.</a> Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).</li><li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), 3958 (2018).</li><li>Jang, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain+protein+Brd4+is+a+positive+regulatory+component+of+P-TEFb+and+stimulates+RNA+polymerase+II-dependent+transcription.">The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription.</a> Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).</li><li>Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suz12+is+essential+for+mouse+development+and+for+EZH2+histone+methyltransferase+activity.">Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity.</a> EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).</li><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+and+its+mark+in+life.">The Polycomb complex PRC2 and its mark in life.</a> Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).</li><li>Peng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+regulates+the+homeostasis+of+CD8(+)+T-lymphocytes+and+their+proliferation+in+response+to+antigen+stimulation.">Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation.</a> Front Immunol. 12, 728082 (2021).</li><li>Marasca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE1+are+spliced+in+non-canonical+transcript+variants+to+regulate+T+cell+quiescence+and+exhaustion.">LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion.</a> Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).</li><li>Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+COMBO+chrRNA-DNA-ImmunoFISH.">3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH.</a> Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).</li><li>Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Multicolor+DNA+FISH+tool+to+study+nuclear+architecture+in+human+primary+cells.">3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells.</a> J Vis Exp. (155), (2020).</li><li>Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+microscopy+analysis+of+radiation-induced+DNA+double-strand+break+motion.">Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).</li></ol>

R.V. tiene una colaboración científica con la startup T-One Therapeutics Srl; B.B. y F.M. son cofundadores de la startup T-One Therapeutics Srl; E.P. es actualmente empleado de T-One Therapeutics Srl; Todos los demás autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

En este estudio, presentamos un método para realizar experimentos de inmunofluorescencia sobre proteínas nucleares en linfocitos T humanos. Este método ofrece flexibilidad para su uso con varios tipos de células a través de modificaciones menores en los pasos de fijación y permeabilización, como se describió anteriormente30,31.
Nuestro flujo de trabajo de imágenes se basa en técnicas establecidas descritas en la literatura, e...

La organización del genoma eucariota está gobernada por múltiples capas de modificaciones epigenéticas1, que coordinan varias funciones nucleares que pueden ocurrir dentro de compartimentos especializados llamados cuerpos nucleares o condensados2. Dentro de estas estructuras, tienen lugar procesos como la iniciación de la transcripción3, el procesamiento del ARN 4,5,6, la reparación del ADN 7,8, la biogénesis del ribosoma 9,10,11 y la regulación de la heterocromatina12,13. La regulación de los cuerpos nucleares se ajusta en las dimensiones espaciales y temporales para adaptarse a los requisitos celulares, guiada por los principios de separación de fases14,15. En consecuencia, estos cuerpos funcionan como fábricas transitorias donde los componentes funcionales se ensamblan y desensamblan, sufriendo cambios en el tamaño y la distribución espacial. Por lo tanto, la comprensión de las características de las proteínas nucleares mediante microscopía, incluida su propensión a formar cuerpos y su disposición espacial en diferentes condiciones celulares, ofrece información valiosa sobre sus roles funcionales. La microscopía de fluorescencia es un método ampliamente utilizado para el estudio de proteínas nucleares, permitiendo su detección a través de anticuerpos fluorescentes o expresando directamente dianas con un reportero de proteínas fluorescentes16,17.
En este contexto, los cuerpos nucleares aparecen como focos brillantes o puncta, con un notable grado de esfericidad, lo que los hace fácilmente distinguibles del ambiente circundante 16,18. Las técnicas de superresolución como STORM y PALM, al proporcionar una resolución mejorada (hasta 10 nm)19, permiten una caracterización más precisa de la estructura y composición de condensados específicos20. Sin embargo, su accesibilidad está limitada por los gastos de equipo y las habilidades especializadas necesarias para el análisis de datos. Por lo tanto, la microscopía confocal sigue siendo popular debido a su equilibrio favorable entre resolución y uso más amplio. Esta popularidad se ve facilitada por la eliminación inherente de la luz desenfocada, que disminuye la necesidad de extensos procedimientos de posprocesamiento para una segmentación precisa, su amplia disponibilidad en los institutos de investigación, su tiempo de adquisición efectivo y la preparación de muestras que suele ser eficiente. Sin embargo, la medición precisa de la distribución, el ensamblaje o la difusión de proteínas mediante ensayos de inmunofluorescencia en diversas condiciones celulares plantea desafíos, ya que muchos métodos existentes carecen de orientación sobre la selección de parámetros adecuados para proteínas con diferentes patrones de distribución21. Además, el manejo del gran volumen de datos resultante puede ser desalentador para los usuarios con experiencia limitada en el análisis de datos, lo que puede comprometer la importancia biológica de los resultados.
Para abordar estos desafíos, presentamos un protocolo detallado paso a paso para la preparación de inmunofluorescencia y el análisis de datos, con el objetivo de proporcionar un método imparcial para cuantificar la tinción de proteínas con varios patrones de organización (Figura 1). Esta tubería semiautomatizada está diseñada para usuarios con experiencia limitada en análisis computacional y de imágenes. Combina las funcionalidades de dos plugins establecidos de Fiji: FindFoci22 y 3D suite23. Al integrar la capacidad de identificación precisa de focos de FindFoci con las funciones de identificación y segmentación de objetos en el espacio 3D que ofrece 3D suite, nuestro enfoque genera dos archivos CSV por canal para cada campo de adquisición. Estos archivos contienen información complementaria que facilita el cálculo de métricas adecuadas para varios tipos de distribución de señales, como el recuento de focos por célula, la distancia de los focos al centroide nuclear y el coeficiente de inhomogeneidad (CI), que hemos introducido para la tinción difusa de proteínas. Además, reconocemos que la extrapolación de datos puede llevar mucho tiempo para los usuarios con habilidades limitadas de manejo de datos. Para agilizar este proceso, proporcionamos un script de Python que compila automáticamente todas las mediciones recopiladas en un solo archivo para cada experimento. Los usuarios pueden ejecutar este script sin necesidad de instalar ningún software de lenguaje de programación. Proporcionamos un código ejecutable en Google Colab, una plataforma basada en la nube que permite la escritura de scripts de Python directamente en el navegador. Esto garantiza que nuestro método sea intuitivo y fácilmente accesible para su uso inmediato.
Demostramos la efectividad de nuestro protocolo en el análisis y cuantificación de alteraciones en la distribución de señales de dos proteínas nucleares: la proteína 4 que contiene bromodominio (BRD4) y el supresor de zeste-12 (SUZ12). BRD4 es una proteína coactivadora bien documentada dentro del complejo mediador conocida por formar condensados asociados con la iniciación transcripcional dependiente de la polimerasa II24,25. SUZ12 es un componente proteico del Complejo Represivo Polycomb 2 (PRC2) responsable de regular la deposición de la modificación de histonas H3K27me326,27. Estas proteínas exhiben diferentes patrones dentro de dos tipos de células distintas: las células T humanas CD4+ naïve recién aisladas, que están inactivas y exhiben tasas lentas de actividad transcripcional, y las células TH1 CD4+ diferenciadas in vitro, que son células efectoras proliferantes especializadas que muestran una mayor transcripción28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendord</td>
			<td>#0030121503</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#612-3700</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#2149P-HR</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352070</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#2069-HR</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36984</td>
			<td>Step 1.3.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A7030</td>
			<td>Step 1.3.6., 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>#130-096-533</td>
			<td>Step 1.1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat#D1306</td>
			<td>Step 1.3.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#1131D</td>
			<td>magnetic beads step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>#4146320</td>
			<td>Step 1.2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria SORP</td>
			<td>BD Bioscences</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10270106</td>
			<td>Step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FICOLL PAQUE PLUS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>GEH17144003F32</td>
			<td>Step 1.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Version 2.14.0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#72298-13</td>
			<td>Step 1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G5516</td>
			<td>Step 1.2.7-1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Step 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320331</td>
			<td>Step 1.3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human neutralizing anti-IL-4</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-095-753</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human recombinant IL-12</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-096-704</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human recombinant IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-097-744</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2&#215;. Frame size 1024&#215;1024 pixel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11140035</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-1552</td>
			<td>Step 1.3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>#557871</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>#552888</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>#130-113-546</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353047</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>Step 1.3.6., 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14190094</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15070063</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P6148</td>
			<td>Step 1.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P8920</td>
			<td>1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody - BRD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab128874</td>
			<td>Step 1.3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody - SUZ12</td>
			<td>Cel Signalling</td>
			<td>mAb #3737</td>
			<td>Step 1.3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#61870010</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11360039</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Step 1.2., 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P9416</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile pipeline for analyzing dynamic changes in nuclear bodies in a variety of cell types

Varios procesos nucleares, como el control transcripcional, ocurren dentro de estructuras discretas conocidas como focos que se pueden discernir a través de la técnica de inmunofluorescencia. La investigación de la dinámica de estos focos en diversas condiciones celulares a través de la microscopía proporciona información valiosa sobre los mecanismos moleculares que gobiernan la identidad y las funciones celulares. Sin embargo, la realización de ensayos de inmunofluorescencia en diferentes tipos de células y la evaluación de las alteraciones en el ensamblaje, la difusión y la distribución de estos focos presentan numerosos desafíos. Estos desafíos abarcan complejidades en la preparación de muestras, la determinación de parámetros para analizar datos de imágenes y la gestión de volúmenes de datos sustanciales. Además, los flujos de trabajo de imágenes existentes a menudo se adaptan a usuarios competentes, lo que limita la accesibilidad a un público más amplio.
En este estudio, presentamos un protocolo de inmunofluorescencia optimizado diseñado para investigar proteínas nucleares en diferentes tipos de células T primarias humanas que se pueden personalizar para cualquier proteína de interés y tipo de célula. Además, presentamos un método para cuantificar de forma no sesgada la tinción de proteínas, ya sea que formen focos distintos o exhiban una distribución nuclear difusa.
Nuestro método propuesto ofrece una guía completa, desde la tinción celular hasta el análisis, aprovechando una tubería semiautomatizada desarrollada en Jython y ejecutable en Fiji. Además, proporcionamos un script de Python fácil de usar para agilizar la gestión de datos, de acceso público en un cuaderno de Google Colab. Nuestro enfoque ha demostrado eficacia en la producción de análisis de inmunofluorescencia altamente informativos para proteínas con diversos patrones de organización nuclear en diferentes contextos.

The organization of the eukaryotic genome is governed by multiple layers of epigenetic modifications1, coordinating several nuclear functions that can occur within specialized compartments called nuclear bodies or condensates2. Within these structures, processes such as transcription initiation3, RNA processing4,5,6, DNA repair7,8, ribosome biogenesis9,10,11, and heterochromatin regulation12,13 take place. The regulation of nuclear bodies adjusts over both spatial and temporal dimensions to accommodate cellular requirements, guided by principles of phase separation14,15. Consequently, these bodies function as transient factories where functional components assemble and disassemble, undergoing changes in size and spatial distribution. Hence, understanding the characteristics of nuclear proteins by microscopy, including their propensity to form bodies and their spatial arrangement in different cellular conditions, offers valuable insights into their functional roles. Fluorescence microscopy is a widely used method for studying nuclear proteins, allowing their detection through fluorescent antibodies or directly expressing targets with a fluorescent protein reporter16,17.
In this context, nuclear bodies appear as bright foci or puncta, with a notable degree of sphericity, making them easily distinguishable from the surrounding environment16,18. Super-resolution techniques like STORM and PALM, by providing improved resolution (up to 10 nm)19, enable more precise characterization of the structure and composition of specific condensates20. However, their accessibility is limited by equipment expenses and the specialized skills needed for data analysis. Therefore, confocal microscopy remains popular due to its favorable balance between resolution and wider usage. Such popularity is facilitated by the inherent removal of out-of-focus light, which diminishes the requirement for extensive post-processing procedures for accurate segmentation, its widespread availability in research institutes, its effective acquisition time, and sample preparation that is typically efficient. However, accurately measuring protein distribution, assembly, or diffusion using immunofluorescence assays across diverse cellular conditions poses challenges, as many existing methods lack guidance on selecting suitable parameters for proteins with varying distribution patterns21. Moreover, handling the resulting large data volume can be daunting for users with limited experience in data analysis, potentially compromising the biological significance of the results.
To address these challenges, we introduce a detailed step-by-step protocol for immunofluorescence preparation and data analysis, aiming to provide an unbiased method for quantifying protein staining with various organization patterns (Figure 1). This semi-automated pipeline is designed for users with limited expertise in computational and imaging analysis. It combines the functionalities of two established Fiji plugins: FindFoci22 and 3D suite23. By integrating the precise foci identification capability of FindFoci with the object identification and segmentation features in 3D space offered by 3D suite, our approach generates two CSV files per channel for each field of acquisition. These files contain complementary information that facilitates the calculation of metrics suitable for various types of signal distribution, such as the count of foci per cell, the distance of foci from the nuclear centroid, and the inhomogeneity coefficient (IC), which we have introduced for diffuse protein staining. In addition, we acknowledge that data extrapolation can be time-consuming for users with limited data handling skills. To streamline this process, we provide a Python script that automatically compiles all collected measurements into a single file for each experiment. Users can execute this script without the need to install any programming language software. We provide an executable code on Google Colab, a cloud-based platform that allows the writing of Python scripts directly in the browser. This ensures that our method is intuitive and readily accessible for immediate use.
We demonstrate the effectiveness of our protocol in analyzing and quantifying alterations in signal distribution of two nuclear proteins: Bromodomain-containing protein 4 (BRD4) and Suppressor of zeste-12 (SUZ12). BRD4 is a well-documented coactivator protein within the Mediator complex known to form condensates associated with polymerase II-dependent transcriptional initiation24,25. SUZ12 is a protein component of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) responsible for regulating the deposition of H3K27me3 histone modification26,27. These proteins exhibit different patterns within two distinct cell types: freshly isolated human CD4+ na&#239;ve T cells, which are quiescent and exhibit slow rates of transcriptional activity, and in vitro differentiated TH1 CD4+ cells, which are specialized, proliferating effector cells showing increased transcription28.

Autor destacado: Análisis epigenético integral para investigar la plasticidad celular humana y la adaptación ambiental mediante ensayos de inmunofluorescencia

Una línea versátil para analizar los cambios dinámicos en los cuerpos nucleares en una variedad de tipos de células

Our main research interest is an epigenetic mechanism that regulates human cellular elasticity and environmental adaptation. I am currently focusing on studying how changes in chromatization within a nuclear condensate three pathological cellular conditions. I believe that studying the biophysical properties of chromatization opens a new field and offers unique opportunities for developing novel therapeutic approaches.Immunofluorescence assays are valuable for screening protein organization in nuclear condensates. However, human genetics can be challenging due to parameter selection issues and large data volume when studying multiple conditions. We offer a comprehensive with guidance on how to use the right parameters and automated analysis pipeline to streamline the process.Our protocol guides user from sample preparation to the analysis. We provided a simulated pipeline design through Doza with limited computation and image analysis expertise. The workflow is accessible to everyone at no cost, and leveraging widely adoptable software like Imogene and Python and the free cloud based service Google Colab.

El protocolo descrito en este método facilita la visualización y cuantificación de las alteraciones en la tinción de proteínas nucleares dentro de las células T primarias humanas, y se puede personalizar para diversos tipos de células y objetivos proteicos. Como casos de estudio, realizamos y analizamos la tinción de BRD4 y SUZ12 en células naïve y TH1 CD4+ .
BRD4 muestra un patrón de tinción bien punteado tanto en las células TH1 ...

Este método describe un protocolo de inmunofluorescencia y un canal de cuantificación para evaluar la distribución de proteínas con patrones de organización nuclear variados en linfocitos T humanos. Este protocolo proporciona orientación paso a paso, comenzando con la preparación de la muestra y continuando con la ejecución de análisis semiautomatizados en Fiji, concluyendo con el manejo de datos por parte de un cuaderno de Google Colab.

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the ...

a-versatile-pipeline-for-analyzing-dynamic-changes-nuclear-bodies

Research

JoVE Journal

Genetics

A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types

277 vistas.  Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM). Nuestro principal interés de investigación es un mecanismo epigenético que regula la elasticidad celular humana y la adaptación ambiental. Actualmente me estoy centrando en estudiar cómo los cambios en la cromatización dentro de un condensado nuclear son tres condiciones celulares patológicas. Creo que el estudio de las propiedades biofísicas de la cromatización abre un nuevo campo y ofrece oportunidades únicas para desarrollar nuevos enfoques terap...

Video: Autor destacado: Análisis epigenético integral para investigar la plasticidad celular humana y la adaptación ambiental mediante ensayos de inmunofluorescencia

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the immunofluorescence technique. Investigating the dynamics of these foci under diverse cellular conditions via microscopy yields valuable insights into the molecular mechanisms governing cellular identity and functions. However, performing immunofluorescence assays across different cell types and assessing alterations in the assembly, diffusion, and distribution of these foci present numerous challenges. These challenges encompass complexities in sample preparation, determination of parameters for analyzing imaging data, and management of substantial data volumes. Moreover, existing imaging workflows are often tailored for proficient users, thereby limiting accessibility to a broader audience.
In this study, we introduce an optimized immunofluorescence protocol tailored for investigating nuclear proteins in different human primary T cell types that can be customized for any protein of interest and cell type. Furthermore, we present a method for unbiasedly quantifying protein staining, whether they form distinct foci or exhibit a diffuse nuclear distribution.
Our proposed method offers a comprehensive guide, from cellular staining to analysis, leveraging a semi-automated pipeline developed in Jython and executable in Fiji. Furthermore, we provide a user-friendly Python script to streamline data management, publicly accessible on a Google Colab notebook. Our approach has demonstrated efficacy in yielding highly informative immunofluorescence analyses for proteins with diverse patterns of nuclear organization across different&#160;contexts.

This method describes an immunofluorescence protocol and quantification pipeline for evaluating protein distribution with varied nuclear organization patterns in human T lymphocytes. This protocol provides step-by-step guidance, starting from sample preparation and continuing through the execution of semi-automated analysis in Fiji, concluding with data handling by a Google Colab notebook.

Investigación

Genética

Quantification Pipeline for Evaluating Protein Distribution with Varied Nuclear Organization Patterns in Human T Lymphocytes

To begin, download and install the latest version of Fiji on a computer. After downloading the convert_to_TIFF. py script, drag and drop the script on Fiji and run the code.Browse to the path where the experiment is stored. The converted TIFF files are created within the same experimental folder. Click on plugins, then 3D Suite, and open the 3D manager options.Within the 3D manager window, select the check boxes corresponding to the volume in unit, mean gray value, bounding box in pixel, standard deviation gray value, centroid in pixel, and centroid in unit. Tick the exclude objects on edges XY, and exclude objects on edges Z.Then, click okay. Open the fluorescent image of human T-lymphocytes.Click Control Shift D to duplicate the protein channel, including the stack. Check the hyper stack checkbox. Specify the appropriate channel number within the channels box and rename it accordingly.To launch the Fiji macro recorder, navigate to the plugins, then macros, and select record. Then, to open the FindFoci plugin, sequentially click on plugins GDSC, FindFoci, and FindFoci GUI. From the image dropdown menu, select the image to be analyzed.Set the Gaussian blur to 1.5, background method to standard deviation above mean, background parameter to nine, search method to fraction of peak background, search parameter to 0.7, peak method to relative above background, peak parameter to 0.2, and minimum size to five. Set the max peaks to high numbers to include all foci in the image. To enhance foci identification, adjust the Gaussian blur close to the foci diameter, and increase the values of the background parameter to impose more stringent thresholds.Then, decrease the values of the search parameter to include areas farther away from the fluorescence peak and decrease the values of the peak parameter for the separation of peaks. Run FindFoci and copy the string that appears in the recorder window. The string contains the selected parameters, excluding the quotation marks.After downloading the nuclear_prod_q. py script, drag and drop the script on Fiji, and click run to execute the code. In the nucleus channel, enter the number corresponding to the channel of DAPI.For nucleus Gaussian blur, enter the value of sigma needed to blur the image for segmentation. Then, enter the number corresponding to the channel of the staining of interest for the protein channel. In the FindFoci parameter, paste the string representing the macro recording of the selected parameters.Tick the visual check box and click browse to select the directory where the images are stored. Once all boxes are compiled, click okay to continue the execution. From the ROI list in the ROI manager 3D window, select the nuclei channel, and click live ROI to on.Select the ROI belonging to the same nucleus and press merge. And for undesired nuclei, press delete. Again, click live ROI to on, select all, and confirm that all nuclei are correctly segmented.From the quantification folder, open the TXT file with records of the parameters used for the analysis. Open Google Colab in a browser. Then, from the file, select open notebook, and upload the final nuclear protein metrics.ipynb script. Upload all the folders containing the CSV files of each image field into a folder of preference in Google Drive. In the notebook, indicate the path of the folder where the results sub-folders are stored and run all cells.When the code has finished compiling, open the final spreadsheet file containing all the compiled data.