Este método puede ser útil para responder preguntas clave en campos de neurobiología como cómo funcionan los terminales presinápticos in vivo. La principal ventaja de este conjunto de técnicas es que mostramos enfoques complementarios para evaluar la función de las vías olfativas utilizando renacuajos Xenopus como modelo animal. Demostrando este procedimiento seremos yo, Beatrice Terni y Paolo Pacciolla.
Comience el procedimiento de transección humedeciendo dos trozos de papel de filtro cualitativo de celulosa en una solución anestésica 0,02%MS2 22 y colocándolas bajo el ámbito de disección. A continuación, elija un renacuajo del tanque y sumerja en un plato de solución anestésica. El renacuajo debe dejar de nadar en un plazo de dos a cuatro minutos.
Compruebe la anestesia adecuada por la ausencia de una reacción a los estímulos mecánicos aplicados a nivel de cola utilizando pinzas. Coloque el renacuajo anestesiado en el papel de filtro debajo del visor. Coloque el animal con su lado dorsal mirando hacia arriba para que las estructuras cerebrales puedan ser visualizadas.
Para experimentos conductuales, usa tijeras veni para transeccar ambos nervios y suprimir toda la información de olores que llega a la bombilla olfativa. Cargue una pipeta de vidrio con dos microlitros de solución de dextrina verde calcio y colóquela en el microinyector. Coloque un renacuajo anestesiado debajo del microscopio de disección sobre el papel de filtro, luego mueva la punta de la pipeta a la cavidad principal de la cápsula nasal y entregue 0,15 a 0,3 microlitros del tinte.
Deje el renacuajo en su lugar durante dos o tres minutos. Con una pipeta Pasteur, gotee una solución de 0,02%MS2 22 sobre las partes más de la misión del animal para evitar el secado. Transfiera al animal al tanque de recuperación donde el renacuajo debe recuperar la natación normal en un plazo de 10 minutos.
Observar la florescencia a nivel de la capa glomerular de la bombilla olfativa el día después de la inyección. Prepare un renacuajo anestesiado para la toma de imágenes eliminando primero la piel por encima de la bombilla olfativa. Utilice tijeras veni para hacer una incisión lateral en la piel del renacuajo en el borde del sistema nervioso central a nivel de la bombilla olfativa.
Evite extender el corte al tectum, que se puede identificar fácilmente por la ubicación del nervio óptico. Mantener el animal húmedo aplicando gotas de 0.02%MS2 22 solución usando una pipeta Pasteur luego pellizcar la piel cortada usando pinzas y tirar de ella sobre el sistema nervioso. Verifique la eliminación exitosa por la ausencia de melanocitos por encima de la bombilla olfativa.
Coloque el renacuajo en el pozo del plato recubierto del protector de celda. Coloque un resbalón de cubierta de vidrio recubierto con grasa de alto vacío para cubrir la parte superior del tectum hasta el final de la cola. Asegúrese de que la bombilla olfativa y los placodes permanezcan expuestos al medio extracelular.
Llene el plato pitri con la solución de Xenopus Ringer que contiene 100 tubocurarina micromolar para prevenir las contracciones musculares. Coloque el plato que sujeta el renacuajo bajo un microscopio vertical. Conecte el depósito que contiene la solución de Xenopus Ringer con el plato utilizando tubos de polietileno para la profusión continua de la solución de Xenopus Ringer.
Empezar a perfunder la solución de Xenopus Ringer. Mantener el nivel de la solución en el plato constante durante todo el experimento. Evaluar continuamente la viabilidad del renacuajo observando la circulación sanguínea a través de los vasos.
Comience la toma de imágenes en vivo utilizando un objetivo de baja ampliación para visualizar el renacuajo. Mueva el eje del micromanipulador para colocar el capilar que entrega la solución de olor en la parte superior de una cápsula nasal, formando un ángulo de 90 grados con el nervio olfativo. Encuentre el bulbo olfativo localizado ipsilateralmente a la cápsula nasal.
Cambie a un objetivo de agua de alto aumento con una larga distancia de trabajo. Compruebe que la emisión de florescencia por I.Glomerular structures debe ser obvia. Comience por pipetear 20 mililitros de solución de aminoácidos frescos en un depósito elevado.
Luego tome seis renacuajos privados de alimentos de su tanque de alojamiento, y colóquelos en dos litros de agua limpia de renacuajo para minimizar la exposición a los olores. Coloque un plato de seis pozos modificado en un transilluminador LED blanco. Llene cada pozo con 10 mililitros de agua de renacuajo.
Coloque un renacuajo por pozo, luego deje reposar durante al menos tres minutos. Comience la adquisición de imágenes y adquiera películas que contengan períodos basales, de estímulo y de recuperación. Una respuesta atractiva se puede detectar como un movimiento hacia la boquilla entregando la solución de aminoácidos.
Devuelva a los animales a su tanque después de tomar imágenes. El seguimiento de las posiciones de la cabeza del renacuajo dentro de un área de 35 milímetros por 35 milímetros, o el tamaño equivalente en píxeles, permite un análisis cuantitativo del comportamiento guiado por olfativos. La línea punteada representa el área proximal a la entrada de la solución de olor.
Las parcelas individuales de movimientos de renacuajo se construyen utilizando coordenadas X Y obtenidas mediante el análisis de imágenes. Las gráficas de motilidad extraídas deben reproducir fielmente imágenes de vídeo. Una región de interés de 8,75 milímetros de radio centrada en la entrada de la solución se utiliza para clasificar la proximidad de los animales a la fuente de olor.
Más tiempo pasado en las proximidades de la boquilla del olor indica un tropismo positivo. El tiempo empleado por los renacuajos cerca de la boquilla durante los períodos definidos, por ejemplo, intervalos de 15 segundos, permite identificar la capacidad de detectar soluciones de aminoácidos. El comportamiento general de una población de renacuajos se puede obtener trazando la distribución de datos individuales.
El tropismo positivo se puede detectar cuando la solución de aminoácidos se prepara a un milimolar o 160 micromolares. Los animales no responden a la aplicación de agua. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como técnicas histológicas o electrofisiología, para responder preguntas adicionales como la alteración de las propiedades sinápticas después de la lesión.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploraran el procesamiento de información olfativa en el renacuajo Xenopus.
