이 프로토콜은 칼슘 활동 패턴을 단일 세포 수준에서 유전자 발현과 상호 연관시키는 데 사용할 수 있으며, 연구자들은 이 두 가지 특징 사이의 관계에 대한 새로운 질문을 조사할 수 있습니다. 전형적으로 전체 조직을 연구하는 이전 접근법과는 달리, 우리의 기술은 칼슘 활동과 유전자 발현 사이의 세포 자율 적 관계를 평가할 수 있게 하는 단일 세포 수준으로 확대됩니다. UV를 통해 35mm 플라스틱 페트리 접시 2개와 35mm 세포 배양 접시 1개를 약 30분간 살균합니다.
라미나르 플로우 후드에서 작업하면 50밀리리터 플라스틱 원뿔관 2개, UV 멸균 페트리 접시 1개, UV 멸균 세포 배양 접시 에 2밀리미터 칼슘 용액 10밀리리터를 추가합니다. 다른 UV 멸균 페트리 접시에 칼슘과 마그네슘 프리 솔루션 2밀리리터를 넣고 100mm 플라스틱 페트리 접시 2개와 젠타미신으로 보충된 35mm 플라스틱 페트리 접시 1개를 채웁니다. 그런 다음 60mm 플라스틱 페트리 접시를 70%에탄올로 채웁니다.
해부 직전에 0.01 그램의 콜라주 누우스 B를 칼슘 용액 의 한 튜브에 철저히 섞습니다. 새로운 60mm 플라스틱 페트리 접시에 용액을 추가하고 해부 현미경을 사용하여 원하는 발달 단계의 배아를 식별합니다. 멸균 이송 파이펫을 사용하여 MMR 플러스 젠타미신을 함유한 100mm 플레이트로 적어도 6개의 적절한 배아를 이동시보도록 한다.
그런 다음 홀딩 플레이트에서 1개의 배아를 MMR 플러스 젠타미신의 두 번째 100밀리미터 플레이트로 옮기고 현미경 아래에 이 해부 판을 놓습니다. 한 쌍의 무딘 집게를 사용하여 배아를 안정화시키고, 배아를 둘러싼 진동막을 미세 한 번의 집게로 조심스럽게 벗겨냅니다. 모든 멤브레인이 제거되면 미세 한 집게를 사용하여 전방 후방 축을 따라 배아를 꼬집어 등쪽 및 복부 영역을 분리하십시오.
새로운 멸균 이송 파이펫을 사용하여 도살 부분을 콜라주용 60mm 플레이트로 1~2분 간 이송한 후 시편을 해부 판으로 조심스럽게 옮기한다. 해부를 완료하려면, 조심스럽게 자궁 내분비의 추정 신경 조직에서 잔류 내분및 중피 오염의 모든 제거하고 부드럽게 칼슘 용액의 35 밀리미터 플레이트에 해출을 전송. 3개의 더 많은 이출이 수집된 경우 P1000 마이크로파이프를 사용하여 4개의 각질을 모두 35mm 의 칼슘 플레이트로 옮기고 마그네슘 이질이 없는 용액을 사용하여 이출물과 공기 물 인터페이스 사이의 접촉을 피하십시오.
그런 다음 접시의 모든 각종이 접시의 중앙에 클러스터되도록 부드럽게 접시를 소용돌이시키고 조직이 소동 할 수 있도록 실온에서 1 시간 동안 표본을 배양합니다. 이 잠복기 도중, gentamicin를 가진 MMR의 두 번째 접시에 마지막 2개의 태아를 전송하고, 이 견본이 방해받지 않고 발전할 수 있도록 접시를 덮습니다. 인큐베이션의 끝에서, 슈퍼 접착제를 사용하여 35mm 세포 배양 접시의 바닥에 마이크로 지배 커버 슬립을 부착하고 P100 마이크로 피펫을 사용하여 해리 된 각질을 수집합니다.
피펫을 세포 배양 접시의 표면에 가까운 얕은 각도로 잡고, 안쪽을 향한 그리드의 구석에 파이펫 팁을 배치하고 그리드 영역을 가로 질러 셀 서스펜션을 단단히 추방한다. 이상적으로, 세포는 단단하고 조밀한 클러스터에 정착할 것입니다. 셀이 실온에서 1시간 동안 접시에 부착되도록 합니다.
세포가 정착하는 동안, 결정하고 형제 대조군 배아의 발달 단계를 기록. 인큐베이션이 끝나면 샘플 접시를 빛으로 보호된 위치로 이동하고 접시 가장자리에서 100 마이크로리터의 용액을 흡인합니다. 이 솔루션을 새로 준비한 플루오-4 AM 플루론 F127 산 용액7과 위아래 파이펫팅과 혼합한 후 전체 볼륨을 샘플 접시에 되돌려 보도록 합니다.
알루미늄 호일로 접시를 섞고 덮기 위해 부드럽게 소용돌이합니다. 실온에서 1시간 후, 생맥주 의 1밀리리터를 신선한 2밀리리터의 칼슘 용액3밀리리터로 교체하십시오. 그런 다음 3밀리리터의 상복부를 신선한 칼슘 용액 3밀리리터로 2회 더 교체하십시오.
칼슘 활동 이미징의 경우, 샘플 플레이트를 주변 광 노출로부터 보호하는 반전된 공초점 현미경의 단계에 놓고 마커를 사용하여 플레이트의 앞점을 표시하여 후속 이미징 세션에서 동일한 시야를 찾을 수 있도록 합니다. 현미경의 밑에 견본을 찾아내고 세포가 응집되거나 개별적으로 구별하기 어려운 이렇게 조밀하지 않은 적당한 시야를 선택하기 위하여 10 및 20 시간 목표를 사용합니다. 식별 가능한 숫자가 필요에 따라 프레임에 있을 때까지 그리드 지배 커버슬립이 보이게 되도록 현미경 포커스를 조정합니다.
그리드 지배 커버슬립을 중심으로 선택한 시야의 밝은 필드 이미지를 얻고 셀을 중심으로 선택한 시야의 밝은 필드 이미지를 얻을 수 있습니다. 격자 표지 슬립과 시야의 명확한 이미지가 없으면 나중에 생성할 물고기 이미지의 셀을 공동 등록할 수 없습니다. 그런 다음 488 나노미터 레이저로 샘플을 조명합니다.
2시간 이미지의 경우 이미징 구성을 수정하여 이미지를 획득하기 위해 구성을 실행하기 전에 8초 간격으로 3.93초의 스캔 시간으로 901 프레임을 기록합니다. 이미징이 완료되면, 현미경 단계에서 플레이트를 제거하고 배양 의 시작 부분에 형제 대조배아의 발달 단계를 기록하는 데 주의를 기울여 실온에서 2 시간 동안 1X MEMFA의 1 밀리리터로 배양 서퍼를 대체하십시오. 실험에 기록된 모든 셀에 대한 흔적을 포함하는 복합 플롯의 시각화는 벌크 또는 인구 측정이 스파이크 동작의 더 미묘한 패턴을 모호하게 할 수 있는 정도를 보여줍니다.
개별 세포의 기록된 프로파일이 격리될 때, 신경 전구 세포의 불규칙한 스파이크 활성 특성의 예는 명확하게 확인할 수 있다. 이러한 복잡성을 정량화하기 위해 스파이크를 정의하기 위해 다양한 매개 변수를 포함하여 다양한 데이터 분석 방법을 적용할 수 있습니다. 플레이트가 대략적으로 처리되거나 시투 혼성화에서 형광 중에 너무 강력하게 수행되는 경우, 세포는 플레이트 표면에서 빠져나져 세포가 이미지 전반에 걸쳐 일치하는 것이 불가능할 수 있습니다.
이 중단이 시야의 일부 셀에만 영향을 미치는 경우 이미지 내의 일부 셀을 감지하고 할당할 수 있습니다. 그러나, 혼성화가 신중하게 수행되고 이미지 간에 셀이 손실되거나 재배치되는 실험에서 최대 양의 데이터가 얻어지나된다. 신경 전구 마커 유전자의 발현과 칼슘 활성을 콜라주하는 실험의 결과는 칼슘 활동의 특정 패턴과 신경 전달기 표현형 사이의 수많은 연관성을 드러낼 수 있습니다.
이 데이터를 통해 연구자들은 간단한 스파이크 계수로 제한되는 대신 이러한 동적 칼슘 패턴과 유전자 발현과의 관계에 대한 보다 복잡한 특징을 조사할 수 있습니다.
