En este video, demostramos cómo expresar construcciones de ADN exógenos en neuronas ópticas y cómo hacer una imagen de los árboles axonales ópticos individuales que expresan GFP en renacuajos Xenopus laevis intactos y vivos. Se trata de un procedimiento sencillo y barato para la transgénesis transitoria específica de células que permite determinar la función del gen autónomo celular en los árboles axonales ópticos individuales, desarrollándose en un sistema de modelo de vertebrado vivo. Demostrando el procedimiento seremos yo, Sophia Dao, Asistente de Investigación, y la Dra. Tamira Elul, Investigadora Principal de Laboratorio.
Para empezar, recorte suavemente la punta de una pipeta micro capilar de vidrio tirado con fórceps finos. Rellene la pipeta micro capilar de vidrio con aceite mineral utilizando un MICROFIL de tal manera que aparezca una pequeña gota de aceite mineral en la punta recortada de la micro pipeta. Llene la pipeta micro capilar de vidrio a mitad de camino con aceite mineral.
En un inyector, expulse el émbolo hasta la mitad y cargue la pipeta micro capilar de vidrio tirado en el soporte de inyección. A continuación, extienda el émbolo en toda su extensión para confirmar que la pipeta micro capilar está fuertemente unida al inyector y no se mueve con la extensión del émbolo. Transfiera una gota de tres microlitros de la mezcla de ADN/DOTAP a una hoja cuadrada de papel de parafina de una pulgada.
Bajo un microscopio de disección estéreo, mueva la punta de la pipeta micro capilar de vidrio a la gota de ADN/DOTAP. Utilice la opción de llenado en el aparato de inyección, succiona lentamente la gota de ADN/DOTAP en la pipeta micro capilar de vidrio. El límite entre el aceite mineral y la solución DNA/DOTAP es visible en la pipeta micro capilar de vidrio debido a la ligera opacidad de la solución DNA/DOTAP.
Si es necesario, deje de llenar periódicamente la pipeta micro capilar para permitir que se recalibra la presión en la pipeta micro capilar de vidrio. En primer lugar, en un plato Petri de 10 mililitros lleno de MMR 0,1X, des-vitellinize manualmente 10 etapa 20 a 24 embriones Xenopus con fórceps finos. Sujete el sobre de la vitellina en la cintura para evitar dañar los embriones.
Con fórceps en la mano izquierda y derecha del experimentador, haga estallar la burbuja del sobre de la vitellina y libere el embrión del sobre de la vitellina. Tenga cuidado de no lesionar los embriones al extraer el sobre de la vitellina. A continuación, utilice una pipeta de transferencia de plástico con una punta cortada para transferir de cinco a 10 etapas des vitelinizadas 22 a 24 embriones a un plato Petri de 10 mililitros lleno de 1X MMR.
Bajo un microscopio estéreo, agarre uno de los embriones des vilitenizados en la placa Petri con fórceps y organice el embrión de manera que su polo anterior se apunte hacia arriba en el campo de visión. A continuación, orientar el embrión de modo que se acueste lateralmente y uno de sus cogollos del ojo izquierdo a derecho está mirando hacia arriba. Sostenga el embrión con los fórceps en la mano no dominante del experimentador y con la mano dominante del experimentador, introduzca la punta de la micro pipeta de vidrio del lado ventral o dorsal justo debajo de la epidermis en el yema del ojo.
Inyectar entre 70 y 210 nanolitros de la solución DNA/DOTAP. A continuación, gire el embrión y realice la misma microinyección en el otro brote del ojo en el lado contralateral del embrión. Inyectar ambos cogollos de seis a 10 embriones en cada experimento.
Después de la microinyección, almacene los embriones en un plato de Petri con 1X MMR durante aproximadamente 30 minutos para facilitar la cicatrización de la herida. Después de 30 minutos, transfiera los embriones inyectados con una pipeta de transferencia de plástico a una solución DE MMR 0.1X con 0.001%agente blanqueador feniltiocarbamida para reducir la pigmentación. Cubra el plato de Petri con una tapa para cultivar los embriones durante aproximadamente cinco días hasta que los embriones se hayan convertido en renacuajos en las etapas 46 a 47.
Este protocolo produce una tasa de éxito de 30 a 60% de los embriones Xenopus inyectados que expresan GFP en uno a 10 árboles axonales ópticos. Las imágenes confocales representativas de GFP muestran el control expreso y los árboles axonales ópticos mutantes en los renacuajos Xenopus intactos. Dos mutantes de dominio de APC, APCNTERM y APBbeta-cat fueron clonados en plásmidos pCS2.
Se reconstruyeron imágenes de la serie Z de control GFP y árboles axonales ópticos mutantes APC. Las gráficas del número de ramas, la longitud total de la rama del árbol y la longitud media de la rama confirman las diferencias observadas entre el control y el mutante APC que expresa los árboles axonales. Las gráficas de dispersión adicionales del número de ramas frente a la longitud media de la rama con las líneas de regresión muestran la correlación inversa entre estos parámetros y los arboresales axonales ópticos que expresan los dominios APC.
La punta de la pipeta micro capilar debe insertarse correctamente muy superficialmente en el capullo del ojo para que la epidermis gris que sobresalía del yema del ojo se hinche durante cada micro inyección. Este procedimiento se puede utilizar para etiquetar y alterar la función genética específica en las neuronas ópticas mientras se evalúa el crecimiento, la focalización y la ramificación de los axones de estas neuronas ópticas. Esta técnica de microinyección y lipofección del ADN ha permitido a los investigadores de la neurobiología del desarrollo estudiar mecanismos moleculares autónomos celulares que regulan la arborización óptica de axón en renacuajos Xenopus laevis intactos y vivos.
