Los receptores inmunes NLR juegan un papel crucial en la mediación de la defensa de la planta contra varios patógenos. Describimos un método de etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación de socios de interacción del dominio de receptor de peaje/interleucina-1 que contiene NLR como receptores inmunes en plantas de Nicotiana benthamiana. Este protocolo proporciona una referencia importante para investigar las interacciones proteína-proteína en otras especies vegetales y puede extenderse a cualquier proteína de interés en Nicotiana benthamiana.
El enfoque de etiquetado de proximidad basado en TurboID tiene una clara ventaja sobre los enfoques tradicionales porque se puede utilizar para capturar interacciones proteína-proteína transitorias o débiles in vivo. Comience por cultivar semillas de N.benthamiana en suelo húmedo a alta densidad. Mantenlos en una cámara climática con una luz de 18 horas y un período de fotos oscuras de ocho horas a 23 a 25 grados centígrados.
Mantener las plantas en la cámara durante unas cuatro semanas hasta que crezcan a una etapa de hoja de cuatro a ocho para la posterior agroinfiltración. Construir fusiones TurboID y transformar los plásmidos en células competentes Agrobacterium tumefaciens como se describe en el protocolo de texto. Utilice una jeringa sin aguja de un mililitro para infiltrarse en el inóculo de la epidermis abaxial de las hojas de N.benthamiana completamente maduras.
A las 36 horas posteriores a la filtración, infíltrate 200 biotina micromolar en las hojas y mantén la planta durante tres a 12 horas adicionales antes de cosechar el tejido de la hoja. Para recoger la muestra de hoja, corte las hojas infiltradas en la base del pecíolo, retire la vena de la hoja y congele el tejido en nitrógeno líquido. Moler el tejido de la hoja con un pestillo y mortero y almacenar el polvo en tubos de halcón de 15 o 50 mililitros a menos 80 grados Centígrados.
Para extraer la proteína total, transfiera alrededor de 0,35 gramos de polvo de hoja a un tubo de dos mililitros. Asegúrese de mantener el tejido a baja temperatura en el nitrógeno líquido durante este proceso. Agregue 700 microlitros de tampón de lysis RIPA al polvo.
Vórtice el tubo durante 10 minutos y deje la muestra sobre hielo durante 30 minutos, mezclando el contenido cada cuatro a cinco minutos invirtiendo los tubos. Centrifugar los tubos a 20.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, recoger el sobrenadante.
Retire la biotina libre ejecutando la muestra a través de una columna de desaladuración. Retire el sellador en la parte inferior de la columna y colóquelo en un tubo de 50 mililitros. A continuación, afloje la tapa y centrifuga la columna a 1.000 veces g y cuatro grados centígrados durante dos minutos.
Coloque la columna de desaladora en un tubo fresco de 50 mililitros y equilibre la columna tres veces con cinco mililitros de tampón de lysis RIPA. Centrifugarlo a 1.000 veces g y cuatro grados Celsius durante dos minutos y desechar el flujo a través cada vez. Añadir 1,5 mililitros de extracto de proteína a la parte superior de la resina en la columna equilibrada.
Y cuando el extracto entre en la resina, agregue otros 100 microlitros de tónifico de lysis RIPA. Centrifugar la columna durante dos minutos y dejar las muestras desaladas sobre hielo hasta su uso posterior. Para cuantificar los extractos de proteínas desaladas, mida el OD595 utilizando un espectrofotómetro Bio-Rad.
Dibuje la curva estándar basándose en el valor de la solución BSA de gradiente y calcule la concentración de las muestras de proteínas desaladas. Equilibrar las perlas magnéticas conjugadas C1 de estreptavidina con un mililitro de tampón de lysis RIPA durante un minuto a temperatura ambiente. Utilice el bastidor magnético para absorber las perlas durante tres minutos y aspirar suavemente la solución.
A continuación, repita el lavado una vez más. Transfiera el extracto de proteína a las cuentas magnéticas equilibradas e incubar el tubo a cuatro grados Celsius durante la noche en un rotador para purificar la afinidad de las proteínas. Al día siguiente, capture las perlas con un bastidor magnético y aspire el sobrenadante.
A continuación, lave las perlas con 1,7 mililitros de tampón de lavado uno añadiéndolo al tubo e incubarlo en el rotor durante ocho minutos. Retire el sobrenadante como se describió anteriormente y repita el lavado con 1,7 mililitros de tampón de lavado dos y lave el tampón tres. Añadir 1,7 mililitros de 50 mililitros Tris HCL para retirar el detergente.
A continuación, coloque el tubo en el bastidor magnético y retire el sobrenadante. Repita el lavado con un mililitro de 50 mililitros Tris HCL y transfiera las perlas a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Por último, lave las cuentas seis veces con 50 tampones de bicarbonato de amonio milimolar durante cinco minutos por lavado.
Utilice 100 microlitros de perlas para el análisis de inmunoblots para confirmar el enriquecimiento de las proteínas biotiniladas y congelar el resto de la muestra a menos 80 grados centígrados. Se utilizaron manchas occidentales para analizar la expresión proteica y la biotinilación en las hojas agroinfiltradas de N.benthamiana. Las proteínas biotiniladas en las hojas infiltradas se enriquecieron eficientemente con cuentas magnéticas conjugadas C1 de estreptavidina para el posterior análisis de espectrometría de masas.
Se capturaron diferentes proteínas con tamaños variados y el análisis de manchas occidentales de las proteínas enriquecidas mostró bandas manchadas. Al intentar este procedimiento, recuerde retirar el sellador en la parte inferior de la columna de desalado y aflojar las tapas antes de cada centrifugación. Este protocolo es fácilmente adaptable a otras proteínas de interés en Nicotiana benthamiana y también se puede utilizar para extender el TurboID PL en otras especies de plantas.
