AirID es una enzima valiosa para la interacción proteína-proteína, y crea menos toxicidad y menos errores en los procesos de tiempo que tardan en llegar que otras enzimas de marcaje de proximidad. Se presenta un protocolo paso a paso para realizar el experimento de marcaje de proximidad en pepino o Cucumis sativus utilizando AT4G18020 proteína APRR2-AirID como modelo. Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng y Min Zhang, de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento.
Comience transfiriendo las semillas de Cucumis sativus o pepino en agua, incubándolas a 50 grados centígrados durante 20 minutos y luego colocando las semillas en el papel de filtro en una placa de Petri durante 12 a 16 horas. Posteriormente, transfiera las semillas a macetas que contengan tierra y cultívelas en una cámara climática a 23 grados centígrados en un período de fotos de 16 horas de luz y 18 horas de oscuridad durante tres o cuatro semanas. Transferir 2,5 microlitros del plásmido EarleyGate 100 a las células competentes de la cepa agrobacterium tumefaciens GV3101.
Incube el tubo en hielo durante 30 minutos antes de transferirlo a nitrógeno líquido durante tres minutos. Para dar el choque de calor, transfiera el tubo a la incubadora a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, coloque el tubo en hielo durante dos minutos.
Añadir 1.000 microlitros de Luria Bertani o medio LB a las células de agrobacterias sometidas al choque térmico. Después de incubar las células a 30 grados centígrados y 118 RPM durante una hora, centrifugarlas a 3000 G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Luego deseche el sobrenadante de 800 microlitros y mezcle la solución restante.
Aplíquelo en el medio LB suplementado con 50 microgramos por mililitro de kanamicina y gentamicina cada uno y 25 microgramos por mililitro de rifampicina. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 horas. Recoge algunas colonias bacterianas de los platos.
Colóquelos en medios líquidos LB, suplementados con antibióticos apropiados e incube LB líquido a 30 grados Celsius y 218 RPM durante 36 a 48 horas. Después de dos minutos de centrifugación a 3.000 G a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el gránulo en un tampón de agroinfiltración para ajustar la densidad óptica a uno en la longitud de onda de 600 nanómetros. Utilizando una jeringa sin aguja de un mililitro, infiltrar toda la epidermis de la superficie abaxial con 1,5 mililitros del inóculo agrobacteriano resuspendido.
Mantenga las plantas en la cámara climática a 23 grados centígrados con 75 micromoles por metro cuadrado por segundo de luz durante 16 horas en condiciones de oscuridad durante ocho horas Después de 36 horas, infiltre un mililitro de cinco microgramos de biotina en las hojas ya filtradas. Después de cuatro a 12 horas de infiltración de biotina, corte las hojas y transfiéralas rápidamente a nitrógeno líquido para evitar la degradación de las proteínas. Muele las hojas con un mortero y agrega rápidamente dos mililitros de PBS BSA de pH 7.4, seguido de una molienda lenta.
Transfiera la mezcla de muestra a un tubo cónico de 15 mililitros a través de un filtro de material de filtración rápida colocado encima y mantenga el tubo en hielo. Transfiera las muestras a un tubo de dos mililitros. Agregue un cóctel de inhibidor de proteínas al 1% y mezcle el contenido girando el tubo hacia arriba y hacia abajo de siete a ocho veces antes de centrifugarlo.
Una vez hecho esto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros y agregue un 10% de beta-D-maltósido. Coloque el tubo en hielo durante cinco minutos antes de centrifugar a 20.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Para equilibrar la columna de desalinización, marque un lado de la columna y centrifugue con el lado marcado hacia afuera.
Retire la cubierta superior e inferior de la columna y vuelva a centrifugar a 1.000 G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Deseche la solución líquida del tubo de recolección de la columna y lave el tubo con cinco mililitros de tampón PBS con centrifugación como se demostró anteriormente, al menos cinco veces. Agregue un mililitro de PBS BSA a 50 microlitros de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1 en un tubo de 1,5 mililitros y mézclelo bien.
Coloque el tubo en un soporte magnético durante tres minutos para absorber las perlas hacia un lado del tubo. Deseche el sobrenadante del otro lado y repita este lavado PBS BSA tres veces. Para enriquecer la proteína biotinilada, añadir dos mililitros de las muestras a la columna.
Después de la centrifugación de la columna a 1000 G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados, agregue un mililitro de extracto de proteína desalinizada a 50 microlitros de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1. Mezcle bien la solución colocando el tubo que contiene las perlas magnéticas en el rotador a velocidad normal y a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, coloque las cuentas en la rejilla magnética durante tres minutos a temperatura ambiente o hasta que se junten en un lado del tubo.
Retire suavemente el sobrenadante y agregue un mililitro de tampón de lavado. Gire el tubo durante dos minutos sobre un rotador y repita el paso realizado en la rejilla magnética para eliminar el sobrenadante. Del mismo modo, realice los lavados con un mililitro de tampones de lavado dos y tres como se demostró anteriormente.
A continuación, retire el detergente de los tampones de lavado añadiendo 1,7 mililitros de clorhidrato tris de 50 milimolares y repitiendo el paso realizado en la rejilla magnética. Dar seis lavados de dos minutos cada uno con un mililitro de tampón de bicarbonato amónico de 50 milimolares. Una vez hecho esto, agregue 50 microlitros del extracto de proteína que contiene 50 milimolares de clorhidrato de tris, 12% de sacarosa, 2% de lauril sulfato de litio y 1,5% de ditiotreitol a las perlas, y coloque el tubo en la incubadora a 100 grados centígrados durante cinco minutos para dar un choque térmico.
Después de repetir el paso en una rejilla magnética, almacene el sobrenadante a menos 80 grados Celsius para el análisis LCMS/MS. El análisis de Western blot de las proteínas extraídas mostró una expresión proteica y biotinilación exitosas en las hojas de pepino infiltradas. El mayor nivel de expresión de las proteínas marcadas y las bandas adicionales en comparación con el control confirmaron el marcado exitoso de las proteínas diana del gen de interés por AirID.
Los resultados se confirmaron mediante anticuerpos Anti-Flag y Anti-Mass mostrando la banda diana con un anticuerpo Anti-Flag en todas las muestras transformadas. Después de enriquecer proteínas biotiniladas con perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1, se observaron múltiples proteínas de diferentes tamaños. De todos los resultados, se concluyó que AirID es una enzima novedosa e ideal para analizar las interacciones proteína-proteína en plantas.
Durante el experimento de marcaje de proximidad, es importante recordar que la biotina de cinco micromolares y la duración de la FC son ideales. El protocolo describe la configuración paso a paso del etiquetado de proximidad basado en AirID en la planta, incluida la preparación de la muestra de hojas, la eliminación de la prebiotina, la cuantificación de la proteína del extracto y el enriquecimiento de las proteínas biotiniladas. Se proyecta que AirID mejore la precisión de la biotinilación independiente de PPI en combinación.
Se concluye que AirID es ideal para el análisis de PPI en plantas.
