Este protocolo es significativo porque proporciona a los investigadores las habilidades para emplear corazones humanos donantes para pruebas de drogas fisiológicas preclínicas. Este tejido utiliza tanto el voltaje como los tintes de calcio para la caracterización simultánea de potenciales de acción cardíaca y transitorios de calcio intracelular en las rodajas de tejido humano. Para configurar el sistema de mapeo óptico, conecte un baño de tejido con una capa de gel polidimetilsiloxano inferior a un sistema de perfusión y circule un litro de solución de recuperación a 37 grados Celsius oxigenado con 100% de oxígeno a través del sistema de perfusión a un caudal lo suficientemente rápido como para mantener la temperatura y evitar la acumulación de baño perfundido.
A continuación, utilice un objetivo para ajustar el enfoque y la alineación de las dos cámaras CMOS y utilice una fuente de luz LED verde con una longitud de onda de 520 más o menos cinco nanómetros para excitar los tintes sensibles al voltaje y del indicador de calcio simultáneamente. Antes de obtener secciones de tejido, mezcle la solución de cardioplegia congelada y líquida y coloque el tejido cardíaco en el baño de cardioplegia helada e identifique la pared libre de ventrículo izquierda. Pegue el gel de agarosa pre-hecho en la parte posterior de los soportes de tejido metálico del vibratomo.
Corte bloques en cubos de un centímetro de tejido en solución cardiopléjica fría y utilice adhesivo tópico para la piel para montar rápidamente los bloques de tejido en los soportes de tejido metálico con las superficies endocardiales hacia arriba. Transfiera los soportes metálicos al baño vibratoma de la solución de corte oxigenado con hielo frío para que los tejidos estén completamente sumergidos y mueva la hoja al borde frontal del tejido. Encienda el vibratome para comenzar a cortar con los parámetros preestablecidos, descartando las primeras varias rebanadas hasta que la hoja llegue más allá del trabeculado en el tejido endocardio liso.
Cuando se haya alcanzado el tejido experimental, transfiera cuidadosamente cada rebanada a coladores de células de malla de nylon individuales de 100 micrómetros en un plato de cultivo que contenga la solución de recuperación de Tyrode oxigenada a temperatura ambiente y cubra las rodajas con arandelas de malla para evitar que las rodajas de tejido se enrosquen. Cuando se hayan recogido todas las rodajas, transfiera cuidadosamente cada rebanada a pozos individuales de una placa de seis pozos que contenga tres mililitros de PBS por pozo. Enjuague la rodaja con un suave balanceo y repita este proceso tres veces con PBS estéril fresco antes de transferir las muestras a pozos individuales de una placa de seis pozos que contenga tres mililitros de medio de cultivo de 37 grados Celsius por pozo.
A continuación, coloque la placa en un agitador orbital a 20 revoluciones por minuto en una incubadora humidificada a 37 grados, 30% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Después de 20 minutos de incubación en la solución de recuperación para rodajas recién cortadas o inmediatamente después del cultivo, transfiera cuidadosamente la rebanada de interés al baño de tejido del sistema de perfusión y pin por las cuatro esquinas a la capa de gel mientras aplica un estiramiento mínimo al tejido. Deje reposar las rodajas en este baño con solución de recuperación circulante durante aproximadamente 10 minutos antes de añadir 0,3 a 0,5 microlitros de stock de Blebbistatin al depósito de solución de recuperación.
Mientras la rebanada está incubando en la Blebbistatin, reconstituir 30 microlitros del tinte sensible al voltaje de las existencias en un mililitro de solución de recuperación a 37 grados. Después de 10 minutos de tratamiento con Blebbistatin, apague las bombas y cargue lentamente de 0,2 a 0,3 mililitros de solución de tinte de trabajo sobre la superficie de la rebanada durante un período de 30 segundos. Después de 90 segundos, encienda las bombas para lavar cualquier exceso de tinte.
Después de morir la rebanada con el indicador de calcio de stock como acaba de demostrar, enfoque las cámaras en la rebanada y el ritmo de la rebanada en un hercio con una duración de ancho de pulso de dos milisegundos a 1,5 veces la amplitud del umbral de ritmo predeterminado. Coloque un cubreobjetos sobre la rebanada de tejido e ilumine la rebanada con la fuente de luz de excitación LED. A continuación, grabe las señales de voltaje y calcio emitidas con las cámaras a 1.000 fotogramas por segundo.
Para acondicionar los datos de mapeo óptico de voltaje y calcio, en el software de análisis adecuado, haga clic en los parámetros de condición y elimine el fondo. A continuación, ajuste los parámetros de acondicionamiento de la señal para obtener un potencial de acción óptimo y trazas transitorias de calcio. Para calcular la velocidad de conducción, seleccione el mapa de activación e introduzca una hora inicial y final para abarcar un único potencial de acción en el seguimiento.
A continuación, haga clic en el mapa regional y seleccione la región de interés para mostrar el mapa de activación de la región seleccionada. A continuación, seleccione el mapa de velocidad de conducción y seleccione las horas de inicio y finalización. Ajuste los valores de resolución entre píxeles en función de la configuración según sea necesario.
Haga clic en Generar mapa vectorial para seleccionar una región de interés y mostrar los vectores de velocidad de conducción dentro de esa región. Se mostrará la media, la mediana, la desviación estándar y el número de vectores incluidos en el análisis, así como el ángulo medio de propagación de los vectores de velocidad de conducción en la región seleccionada. Para calcular la duración potencial de la acción, seleccione la duración potencial de la acción, el mapa de duración transitoria de calcio y seleccione las horas de inicio y finalización para abarcar un potencial de acción completo.
A continuación, haga clic en el cálculo de duración potencial de acción regional para seleccionar una región de interés y generar el mapa de duración potencial de acción. Para determinar el tiempo de subida, seleccione el tiempo de subida y seleccione las horas de inicio y finalización para seleccionar la salida hacia arriba de un solo potencial de acción o transitorio de calcio. Introduzca los valores de porcentaje inicial y final y haga clic en Calcular para seleccionar la región de interés y determinar la media, la mediana, la desviación estándar y el número de píxeles incluidos en el análisis del tiempo de subida.
Para determinar la caries de calcio, seleccione la caries de calcio e introduzca las horas de inicio y finalización para abarcar toda la porción de caries de una sola señal transitoria de calcio. A continuación, haga clic en Calcular tau para seleccionar la región de interés y determinar la media, la mediana, la desviación estándar y el número de píxeles incluidos en el análisis de la constante de tiempo de descomposición del calcio. En este experimento representativo, el potencial de acción y las trazas transitorias de calcio fueron condicionadas por la señal.
Los tiempos de activación se determinaron para cada píxel y los mapas isocronales de los tiempos de activación se trazaron a partir de los rastros de voltaje condicionado y calcio. Los vectores de velocidad de conducción se calcularon utilizando los tiempos de activación y la resolución entre píxeles conocida. La constante de caries transitoria de calcio se midió ajustando un polinomio a la porción en descomposición de los rastros de calcio.
La duración potencial de la acción y la duración transitoria del calcio se midieron como la duración del tiempo entre el tiempo de activación y un porcentaje especificado de la repolspolarización o eliminación de calcio del citoplasma respectivamente. Los tiempos de subida de los rastros de tensión y calcio también se midieron y mapearon. En este análisis representativo, se probó el efecto de la doxorubicina en la conducción cardíaca, lo que resultó en una reducción de la velocidad de conducción transversal.
Es importante asegurarse de que las rebanadas están en completa detención cardiopléjica para minimizar el daño al tejido durante el procedimiento de corte y para obtener rebanadas viables. Al final del protocolo, las rebanadas pueden congelarse o fijarse para su evaluación molecular. Las vías mecanicistas involucradas en el fenómeno electrofisiológico de interés pueden determinarse.
El desarrollo de este modelo de rebanada cardiaca humana ha permitido el estudio de las respuestas a tratamientos y enfermedades en el tejido cardíaco humano que cierran la brecha entre los estudios animales y clínicos. Cuando trabaje con tejidos humanos mientras realiza esta técnica, asegúrese de usar el EPP adecuado y de tomar cualquier otra precaución de seguridad necesaria.
