La insuficiencia cardíaca es la principal causa de muerte tanto para hombres como para mujeres en el mundo. Nuevas pruebas sugieren que la alteración del metabolismo cardíaco y sistémico contribuye a la patología de la insuficiencia cardíaca. Identificar rápidamente qué metabolitos afectan el acoplamiento excitación-contracción sigue siendo un desafío.
El enfoque tradicional de aislar el miocito cardíaco del ratón adulto es un proceso lento y desafiante. El método innovador de este artículo hace que un proceso estricto sea más eficiente y fácil de realizar. Además, utilizando sonda fluorescente, podemos realizar muchas evaluaciones fenotípicas de cómo los productos químicos pueden inducir toxicidad cardíaca o disfunción a nivel celular.
Mediante la identificación de qué moléculas alteran la función de los miocitos, se pueden identificar nuevas terapias para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. Usando ratones transgénicos, podemos sondear diferentes genes para determinar cuáles pueden prevenir y contribuir a la insuficiencia cardíaca. Esta información será esencial en el curado futuro de la insuficiencia cardíaca.
Demostrando el procedimiento serán Matthew Klos y un estudiante Shreyas Suresh. Para empezar, descongele la solución de laminin de trabajo sobre hielo. Usando una pipeta P1000, aspira 200 microlitros de laminina y arrastra suavemente la punta de la pipeta a lo largo de un borde de la cubierta esterilizada para permitir que la acción capilar extraiga una cantidad minúscula de laminina para facilitar la fijación del cubreobjetos a la placa de seis pozos.
A continuación, expulse la laminin restante en el centro del cubreobjetos en un movimiento circular. Extienda la gota de laminin a través del cubreobjetos. Coloque los cubreobjetos en una incubadora de 37 grados Celsius durante al menos una hora y hasta 24 horas antes del aislamiento.
Para aislar los miocitos de un corazón preparado en KHB-HB frío, coloque la muestra bajo un microscopio estéreo. Para prevenir los émbolos, primee la cánula aórtica sumergiéndola en la solución KHB-HB y utilizando una jeringa de 20 mililitros para forzar la solución. Asegúrese de que el corazón esté sumergido y de que la cánula esté cebada antes de la escisión cardíaca.
Con 5 fórceps, cánula el corazón. Confirme el posicionamiento adecuado de la cánula visualizando la punta de la cánula aproximadamente un milímetro por encima de la inserción aórtica en el ventrículo. A continuación, inicie el flujo de KHB-HB girando el llavero en el Langendorf.
Conecta la cánula con el Langendorf para perfumar el corazón durante cinco minutos. A continuación, gire la llave para cambiar la perfusión del depósito KHB-HB al depósito del amortiguador de digestión. Una vez que el tampón de digestión llegue al corazón, ajuste un temporizador.
Recoger el perfundato en un vaso estéril de 100 mililitros. Rellene el depósito del amortiguador de digestión según sea necesario con el perfuso hasta que haya expirado el tiempo de digestión. Después de la digestión, en un vaso estéril de 100 mililitros, separa las cámaras del corazón con fórceps e tijeras de iris.
Coloque cada cámara en un pozo separado de un plato de seis pozos. Vierta cinco mililitros de solución de colagenasa en cada pozo. Utilice inmediatamente tijeras para picar el tejido cardíaco en trozos de aproximadamente un metro cúbico.
Usando una pipeta de transferencia estéril, tritura suavemente el tejido cardíaco picado con tampón de digestión. Una vez que los trozos de tejido se vuelvan blancos y emplumados, coloque la placa debajo de un microscopio invertido para examinar las células. Si el número de células viables es mayor que el 80%, proceda a colar las células en un tubo cónico de 50 mililitros utilizando un colador celular de 100 micras.
Si el número de células viables es inferior al 80% compruebe el tiempo que tardó en cannularse. Si el tiempo de cannulación es de más de cinco minutos, prueba con otro corazón. Si no es así, ensayo de nuevas ranuras de colagenasa a través del programa de muestreo de colagenasa.
A continuación, peletizar las células centrifugando a 215 veces g durante dos minutos. El pellet debe ser compacto y no suelto. Si el pellet está suelto, la preparación contiene muchas células muertas.
En una capucha de cultivo de tejido, resuspender el pellet compacto en 10 mililitros de tampón de parada. Pele el gránulo de las células de nuevo centrifugando a 215 veces g durante dos minutos. Resuspender las células en cinco mililitros de tampón de chapado.
Realice un recuento celular en un contador de citos y ajuste el volumen del búfer de chapado para alcanzar una concentración final de miocitos de dos veces 10 a las cuatro células por mililitro. Ahora retire los cubreobjetos recubiertos de laminina de la incubadora. Aspirar la gota de laminin si está presente.
Placa 200 microlitros de suspensión de miocitos en cada cubrelip. Coloque los cubreobjetos en una incubadora de 37 grados Celsius con 21% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante dos horas para permitir la fijación. Después de dos horas, saque los cubreobjetos y aspire las células no atadas.
Añadir dos mililitros de medios de cultivo y cultivo en la incubadora a 37 grados centígrados durante un máximo de cuatro días. En primer lugar, retire el componente A y el componente B del kit de potencial de membrana. En un tubo cónico de 15 mililitros, combine 50 microlitros del componente B y cinco microlitros del componente A para formar una mezcla de tinte de voltaje.
Vórtice para mezclar. Añadir 10 mililitros de medios de enchapado al tubo cónico de 15 mililitros que contiene la mezcla de tinte de voltaje para formar la mezcla de tinte potencial de membrana. Una vez más, vórtice para mezclar.
A continuación, retire un plato de seis pozos de miocitos de la incubadora. Aspirar a los medios. Agregue 800 microlitros de la mezcla de tinte potencial de membrana a cada pozo.
Cubra la placa con papel de aluminio y deje la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de eso, aspirar la mezcla de medios de tinte de cada pozo y añadir un mililitro de solución modificada de Tyrode a cada pozo. Cubrir con papel de aluminio.
Encienda el equipo en el orden del microscopio, la lámpara de arco, el HyperSwitch, el sistema de interfaz de fluorescencia, la fuente de alimentación MyoCam, el estimulador de campo y el ordenador. Asegúrese de que los conjuntos de filtros de emisión de excitación sean adecuados para el tinte de imágenes. Por ejemplo, fura-2 se excita a 340 nanómetros y 380 nanómetros de luz.
Emite a 510 nanómetros de luz. Fluo-4 y el tinte de membrana de voltaje se excitan a 485 nanómetros de luz y emiten a 520 nanómetros de luz. Ena levante el sistema de grabación encendiendo el vacío, abriendo completamente la abrazadera de la manguera y hundiendo suavemente cada jeringa de 60 mililitros con la solución de Tyrode en el colector.
Para las grabaciones de calcio, utilice la solución estándar de Tyrode. Para grabaciones de voltaje, utilice la solución modificada de Tyrode. Encienda el calentador en línea.
Mantenga la temperatura para que el perfuso en la cámara esté en 36 más o menos un grado Celsius durante al menos 15 minutos. A continuación, abra el software de adquisición. Asegúrese de que los parámetros estén configurados para el tinte de imagen correcto.
Apague el estimulador. En la oscuridad, retire la lámina de la placa de seis pozos y coloque un cubreobjetos en la cámara de ritmo. Coloque la placa bajo un microscopio y concéntrese en los miocitos utilizando el objetivo 10X.
Una vez en el foco, empezar el ritmo por campo estimulante a un hercios y 0.2 voltios. Aumente gradualmente el voltaje hasta obtener un ritmo uno a uno. A continuación, aumente la tensión hasta 1,5 veces que se alcance el umbral.
Cambia del objetivo 10X al objetivo 40X. Concéntrese en una celda que está siguiendo un ritmo uno a uno. Ajuste las tonalidades de plástico para que solo haya una celda en el campo de visión.
Usando el software, coloque el cuadro de área de interés en sarcomeres bien definidos. Inicie el software de adquisición para iniciar la luz de excitación. Con los filtros de densidad neutra, ajuste el ajuste de intensidad en consecuencia para obtener una relación señal-ruido adecuada.
Aquí, se muestran los rastros representativos de acortamiento de calcio y sarcomere registrados a partir de miocitos de ratón C57BL/6 usando fura-2. Una cuantificación de los datos promediados del conjunto obtenidos de ratones C57BL/6 y sus compañeros de camada transgénicos no muestra ninguna diferencia entre los grupos, excepto por el tiempo de relajación a 10 hercios. El seguimiento de voltaje registrado desde un miocito de ratón C57BL/6 con un ritmo de 10 hercios fue procesado posteriormente para obtener una señal utilizable.
El conjunto promedió el potencial de acción después de aplicar un pase bajo Butterworth o un filtro digital Savitzky-Golay que muestra sutiles diferencias en la forma de los potenciales de acción. Las trazas registradas de miocitos de rata a ritmo en un hercio muestra, además de que la señal de voltaje es más baja que la señal de calcio, la cinética de contracción también es diferente. Esto se debe a que los tintes de calcio amortiguan el calcio, mientras que los tintes de voltaje no lo hacen.
Al igual que con el transitorio de calcio, los miocitos demostraron cambios dependientes del ritmo en su duración potencial de acción óptica. También se demostró la prolongación inducida por drogas del potencial de acción. Los últimos 11 segundos de una grabación de 20 segundos indicaron que la exposición prolongada de los miocitos a la luz azul conduce a la actividad desencadenada.
Al intentar este procedimiento, lo más importante a recordar es usar la luz de menor intensidad posible para que no dañes los miocitos. Miocito aislado utilizando nuestro enfoque también se puede utilizar para la inmunohistoquímica o llevado a cabo para el análisis de manchas occidentales. La belleza de esta técnica, permite a los investigadores evaluar rápidamente cómo la variedad de moléculas y genes ayudan al acoplamiento excitación-contracción utilizando un solo sistema.
